BioTechnicalフォーラム [トリプシン／EDTA]

トリプシン／EDTA

No.6942-TOPIC - 2018/05/26 (土) 01:47:09 - trp

Trypsin/EDTAを初めて自分で買おうと思うんですけど、結構色々な種類があって悩みました。

Trypsingは0.05％と0.25％がありますが、原則0.05％で十分でしょうかね？
同じ値段だったので、高濃度の方がお得か？とか思ったんですが、主に使うのはHEK293なので、微妙な持ち込み（無視できる量だと思いますが）によって無意味に剥がれやすくなったりしても嫌だなと思い、0.05％にしました。

HeLaもたまに使うんですが、HeLaのような剥がれにくいのには0.25％の方が良かったりするものでしょうか？

使用感やアドバイスありましたら幸いです。

あと、CaやMgはなしのものでいいと思うんですが、重炭酸ナトリウムが、ありかなしか両方あってこれも迷いました。

例によって同じ値段だったので、せっかくなら緩衝能のためにもありの方がいいかな、と思ったのですが、これに関してもBicarbonateはない方が良い、いやいやあった方が良い、とかありましたらご教示いただけるとありがたいです。

よろしくお願いします。
　

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No.6942-11 - 2018/05/27 (日) 20:41:22 - AA

何種類か接着力の異なる細胞をあつかっているので、
0.25%を購入し、HEKのときはDMEMで0.05%にして使っています。
EDTA濃度が下がってしまいますが、実際剥がれているのでいいのかなと思っています。

(無題)

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No.6942-10 - 2018/05/27 (日) 10:28:27 - TS

>0.25％をPBSで5倍に希釈して使ってます。

これは１Xで売らているもなので、たぶん使い方としてはイレギュラーでは？
EDTAが標準よりも薄くなるでしょう？
PBS-EDTAで薄めるという手はあるかも。

まぁ特段の問題は起きないのはわかりますが。

(無題)

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No.6942-9 - 2018/05/26 (土) 13:54:05 - 田中

0.25％をPBSで5倍に希釈して使ってます。

(無題)

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No.6942-8 - 2018/05/26 (土) 11:28:54 - awsdefrgty

Trypsin処理に弱い（感受性が高い）細胞があります。市販の初代培養大動脈または冠動脈血管内皮細胞などはたしか0.05%trypsinで、処理時間も？分以内とか注意が書いてありました。細胞表層の蛋白質が壊れすぎると接着や生存に影響が出やすいみたいです。専用のTrypsin/EDTAと中和用培地が別売りで売ってます。
一般の株化細胞の多くは0.25%でOKとおもいますが、初代培養細胞等は細胞の感受性に応じて使いわけてるのではないでしょうか。特にそうした注意が記載されていないか、あるいは0.25%で普通に接着、増殖してるならそれでよいとおもいますし、何か調子悪い感じなら0.05%にしたらどうでしょうか。。

(無題)

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No.6942-7 - 2018/05/26 (土) 06:04:36 - おお

>さすがに市販のTrypsin/EDTA solutionなら不純物等はなさそうに思いますが

多分ソースはmomさんが言うところの粉末のトリプシンで不純物は自分で作ったものと変わらないでしょう。

そういう不純物の影響を排除するためにTrypLE Expressが開発されたはずです。TrypLE Expressのカタログなどに書いてある謳い文句を見てみるといいです。

FBSは狂牛病の関係で販売ルートが限られたり、検査項目が増えたりなどで高くなる傾向にあるようですが、いまの現状はよくわかりません。５００ml ３万ぐらいで手に入ることもあったかもしれませんが、５万でもそんなに驚かないです。相場としてはそんなもんです。日本のラボにいるなら出入りの業者に安いところがあるか聞いてみてもいいかもしれません。

(無題)

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No.6942-6 - 2018/05/26 (土) 04:43:49 - trp

あ、入れ違いでしたがmonさんもありがとうございました。

さすがに市販のTrypsin/EDTA solutionなら不純物等はなさそうに思いますがどうでしょうね。

ところでTrypsinは驚くほど安いのですが（100 mL 500円程度）、FBSってこんなに信じられないぐらい高かったでしたっけ？（500 mL 5万円とか）
培地の安さに比べて、何であんなに高いんですかね…？何か常に価格が上がってる気もして、値段を見るたびたまげる感じです。
動物由来試料の採取がどうたらとかがあるのかもしれませんね。

トピックと全く関係ない話で失礼しました。

(無題)

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No.6942-5 - 2018/05/26 (土) 04:28:16 - trp

おおさん、どうもありがとうございます。

素晴らしい表ですね。軽く調べて0.05％の方が基本かと思ってたんですが、0.25％がむしろメインっぽい感じなんですかね。

しかしそもそもHEK293程度なら、EDTAのみでもいいのかな、という気もしてきました。

実はラボには複数のTrypsin（結構古いのも）があって（テクニシャンがおらず個人個人が適当に買っていた歴史のあるラボだからかもしれませんが）、これまで特に気にせず古い方から使っており、どれもHEKでは問題ない感じだったので深く考えていなかったのですが、あえて新しいのを買うならどれがいいのかな、と疑問に感じて質問してみた次第でした。

別の細胞種を使うことがあれば、お示しいただいたTrypLE Expressは良さそうですね。

情報誠にありがとうございました。

(無題)

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No.6942-4 - 2018/05/26 (土) 04:15:45 - mon

私もTrypLE Expressを使っています。
昔ながらのtrypsin（粉末をPBSに溶解＞フィルター滅菌）は不純物のproteaseも多く、細胞種によってはダメージが出やすい感覚がありました。
使い方としては、10cm dishならPBS+EDTA5mLで細胞をリンス、TrypLE Expressを数滴(300uL程度)垂らし、全体になじませ、37℃(CO2インキュベーター）で保温。
剥がれてきたら血清いり培地5mL程度でピペティングしながらほぐして回収、とケチケチ使っています。
TrypLE Express液量は接着が強いHeLaだと多めかな。

(無題)

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No.6942-3 - 2018/05/26 (土) 02:27:57 - おお

あといままで使っていたのはどれなんでしょうか？それを無視しているのに意図があるのでしょうか。

(無題)

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No.6942-2 - 2018/05/26 (土) 02:25:16 - おお

もう忘れてしまいましたが、以下のURLによると、大抵のCell lineなら0.25%かな。がん細胞が中心なので多重になっている可能性もあるので。ただ濃度が高いほうが細胞に悪影響が出やすいです。なので0.05%で対応している人もいるかも知れません。

BicarbonateはCO2インキュベーターでpHを保つためのものではないですか？Bicarbonateが入ってないのはリン酸バッファーなどでpHを合わせていると思いますが。

最近はTrypLE Express（ThermoFisher/GIBCO)をつかってます。

https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/trypsin/trypsin.html?gclid=Cj0KCQjw6J7YBRC4ARIsAJMXXsfW1L_ccZtilu-hCMoD8O47z0kpCSI7mWsP7cXfl4OT2OuAqJ0UUUEaAl6sEALw_wcB&s_kwcid=AL!3652!3!184896913588!e!!g!!trypsin%20edta&mkwid=s-dc_pcrid_184896913588_pkw_trypsin%20edta_pmt_e_slid__dimid=&ef_id=WJzSgwAAAWslpl2u:20180525170844:s

下の方にChoose the proper cell dissociation productという表があります。

トリプシン／EDTA

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No.6942-1 - 2018/05/26 (土) 01:47:09 - trp

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