BioTechnicalフォーラム [DNA変異細胞割合の定量的測定]

ご意見ありがとうございました

No.695-20 - 2012/07/06 (金) 07:43:12 - ち

皆様

ご意見ありがとうございました。
ラボで検討した結果、まずTaqman加水分解プローブでやってみよう、という事になりました。
連続変数として結果が得られ、定量という意味で一番良いだろう、という理由でした。

PCRからのサブクローニング＋コロニー拾ってシークエンス、は、
手間と定量性の観点から次善の策扱い。
その他は器具がない、お金がかかる、定量という部分で今ひとつ、etcで今回は選ばれませんでした。

実際にやってみて、また疑問などありましたら投稿いたします。
いったんこのスレッドは解決済みとさせていただきます。
重ねて皆様のコメントに御礼申し上げます。ありがとうございました！

(無題)

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No.695-18 - 2012/07/06 (金) 07:13:58 - ab

> >それでしたら、PCR産物を昔シークエンスで使ったようなurea入りの長いSDSゲルに流すというのはどうでしょうか。シークエンスゲルでは1000bpと1001bpが分けられるのですから。
> 上記は質問者様の最初の2)とだいたい同じことだと思います。

ちょっと違う気がします…
質問者の方も勘違いされているようですが、PCR産物をシークエンス用のPAGEで分離するということでしょう。
最近は60cmのゲルとか作る機会がないから、ちょっと想像できないかもしれませんね。

2 bp程度であればPCRの増幅効率はそれほど変わらないと思いますが、泳動の結果を取り込んでどの位の感度で解析できるかが肝ですね。

SNPの検出に、2種類のプローブでTaqMan法で解析する方法もあるそうです。
ホモかヘテロであれば簡単に見分けがつくと思いますが、やはり割合となると難しいかもしれませんね。

(無題)

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No.695-17 - 2012/07/05 (木) 17:55:37 - 橘

「コストの関係で、deep sequencingはボスに却下」という話ですが、本当にコストはわかってますか?
Roche 454 GS Juniorで1ラン10万リードのコストは13万円で、Life Tech Ion PGMで1ラン100万リードのコストはさらに安いです。
受託解析業者に頼むと当然これより高くなりますが、タカラバイオや北海道システムサイエンスなどに見積りを依頼してみてはどうでしょうか。
思っているより安いかもしれませんよ。

(無題)

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No.695-15 - 2012/07/04 (水) 16:15:40 - R

>それでしたら、PCR産物を昔シークエンスで使ったようなurea入りの長いSDSゲルに流すというのはどうでしょうか。シークエンスゲルでは1000bpと1001bpが分けられるのですから。

上記は質問者様の最初の2)とだいたい同じことだと思います。

>リアルタイムPCRの検出感度だとちょっと厳しい印象です。

ダイレクトシーケンスできているのであれば、問題ないかと。

>変異部をまたぐプライマーとまたがないものを設計し

欠失を含むものと含まない加水分解プローブを用意してreal-time PCRするのが、質問者様の環境だとよろしいのではないかと思います。

(無題)

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No.695-14 - 2012/07/04 (水) 15:42:47 - ち

中年様

コメントありがとうございます。

はい、既知の変異は２塩基欠失のみです。

プライマーをラベルしたPCRを考えると、（ラベルは核酸の方ですが）
リアルタイムPCRが一番近いと思われます。
ご指摘の通り、増幅産物の定量的評価に適していると思われますので、
検討させて頂きます。ただ、（実は最初に書いた時から思っていたのですが）
リアルタイムPCRの検出感度だとちょっと厳しい印象です。
今一度考えてみます。

次のご指摘は、アガロースゲル電気泳動で得たイメージを、ウエスタンブロットよろしく
NIH Imageなどのソフトウェアで解析する方法だと思われます。
蛋白量の解析としては一定の評価が得られていますが、
既報でこの方法をPCR産物に用いた報告があるか、検索してみます。

1bp程度の差異を検出できるゲルの存在は、恥ずかしながら存じませんでした。
応用可能であれば簡便かつ有用と思われます。
検索してみます。

重ねて、多岐にわたるコメント、本当に勉強になりました。

引き続き皆様のコメントをお待ちしております。

(無題)

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No.695-13 - 2012/07/04 (水) 15:30:46 - 中年

舌足らずですみません。

そのゲルを何かで染色してバンドの強度比を見るとか、プライマーをラベルしておいてそのシグナル比を見るとか。

蛍光プライマーを使えばゲルでなくてシーケンサーでもできそうな気がします。

(無題)

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No.695-12 - 2012/07/04 (水) 15:27:55 - 中年

変異は２塩基欠失一種類だけということで間違いないでしょうか。つまり、野生型のPCR産物が例えば300bpだとしたら変異型は298bpということ。

それでしたら、PCR産物を昔シークエンスで使ったようなurea入りの長いSDSゲルに流すというのはどうでしょうか。シークエンスゲルでは1000bpと1001bpが分けられるのですから。

コメントありがとうございます

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No.695-11 - 2012/07/04 (水) 15:21:28 - ち

中年様
コメントありがとうございます。
残念ながら、コストの関係で、deep sequencingはボスに却下されております。
できれば最高なのですが…。

引き続きコメントお待ちしております。

(無題)

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No.695-9 - 2012/07/04 (水) 14:28:44 - ち

皆様コメントありがとうございました。

cu様
ご指摘の通り、臨床検体は悪性腫瘍の体細胞変異＋野生型のモザイクです。
また、最初に頂いたコメントを誤読しておりました。お詫びいたします。
（PCR→サブクローニング→コロニーを拾って比率を検討、を、
　細胞検体を培養→コロニーを拾って比率を検討、と勘違いしておりました。）
ご教授頂いた方法、充分に検討に値すると思われます。
ありがとうございました。

-様
コメントありがとうございました。
実はご指摘頂いた方法、検討したのですが、
「100%ミュータントのコントロール」が用意できず断念いたしました。
ただ理論的にはこれでやるのが一番簡便だと思われますので、
コントロールの入手含め今一度検討します。
また、シングルセルPCR目的のシングルセルソーティングを
近隣のラボで行なっておりますので、こちらも検討してみます。

R様
誤読のご指摘ありがとうございました。お陰様で皆様のご意見をすっきり整理できました。
残念ながら、in vitroの培養で増殖する細胞ではありませんが、
上記の通りシングルセルソーティングは可能と思われますので、
その方向含めて検討いたします。

だいぶ方向性が整理できましたが、
もし他にもコメント頂ける方がいらっしゃいましたら大歓迎です。
引き続き皆様のご意見をお待ちしております。

コメントありがとうございます

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No.695-7 - 2012/07/04 (水) 12:12:53 - ち

皆様コメントありがとうございます。
最初のcu様のコメントを誤読しておりました（Rさまの書き込みを読んで気付きました）。
後ほど詳しくご返答さて頂きます。だいぶ頭の整理がつきました！

(無題)

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No.695-6 - 2012/07/04 (水) 10:23:15 - R

>コロニー拾うのは、細胞株の場合良いアイデアだと思われますが、
残念ながら今回は検体が臨床由来ですので、使えないと思われます。

>いずれにしてもやることは検体採取、DNA抽出、PCRしてサブクロ、トランスフォームさせて得られた大量のコロニーをシーケンスするなら比はわかるように思いますが。

cu様のご提案に賛成です。
エピジェネティクスのDNAメチル化解析なんかに使われています。
一応、明確にしておきますが、ダイレクトシーケンスではなく、サブクローニング後のシーケンスです。
細胞株とか臨床検体とかは関係ないですね。

ヘテロかホモかについては、培養ができるのであればシングルセルから培養して解析。

他には次世代シーケンスなんかで使われている1分子PCRを応用してなんかないですかね。

(無題)

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No.695-5 - 2012/07/04 (水) 09:32:12 - ~

どのくらいの精度の定量が希望なのでしょうか？
また、どのような定量のためのコントロールが用意できるのでしょうか？

正常型、変異型の細胞自体が用意できるのであれば、
それぞれからゲノムDNAを抽出し、ブレンド比を変えて１や２を行うことで、
PCRの増幅効率を加味した定量ができると思います。

正常型、変異型が混ざっている状態で、そのうちの変異型がホモかヘテロかを調べるのであれば、検体そのままでのゲノムDNA抽出はできませんよね。
シングルセルPCRで、正常型、変異型のそれぞれのプライマーで増えるかどうかのチェックをすればできるかと思いますが…
細胞を酵素処理等でほぐして、セルソーター等で各ウェルに1細胞ずつ分け、
変異型でPCRをして、ポジティブのウェルで正常型のプライマーでも増えるかを確認する？
ただ、正常型の遺伝子はあっても1コピーですので、変異型の検出方法や、変異型由来で増えたPCR産物の除去法が問題になるかもしれません。

ヘテロが期待されるのであれば、in vitroで培養し、得られた変異型クローンがヘテロであることを示すことで後付けできるかもしれません。
変異型ホモの場合は後から正常型の染色体が抜け落ちたりLOHが起きたといわれるかもしれませんが、正常型、変異型の両方が検出されれば、元もヘテロだったと主張できるかと思います。

(無題)

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No.695-4 - 2012/07/04 (水) 05:08:33 - cu

細胞株じゃなくて臨床検体でしたか。癌細胞における体細胞変異、あるいはそれ以外のモザイクをきたしている疾患の検体でしょうか？

いずれにしてもやることは検体採取、DNA抽出、PCRしてサブクロ、トランスフォームさせて得られた大量のコロニーをシーケンスするなら比はわかるように思いますが。

ホモかヘテロかは全く情報がなければ、かなり難しそうですね。もちろん上記のどのような疾患を想定しているかによると思います。他の方のアイディアを待ちましょう。

コメントありがとうございます

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No.695-3 - 2012/07/04 (水) 03:34:33 - ち

cuさま

コメントありがとうございました。

２）が難しいのはは自分も感じております。
大雑把に100%か50%かゼロか、くらいしか言えない感じです。
コロニー拾うのは、細胞株の場合良いアイデアだと思われますが、
残念ながら今回は検体が臨床由来ですので、使えないと思われます。
となるとPCRでしょうかね。

変異株がホモかヘテロか、については、ヘテロだという前提で行っていますが、
実はここも確認の方法があればなぁ、と思っておりますので、どなたかアイデアを
頂ければ…、と存じます。

少し頭の整理がついてきました。
引き続きコメントお待ちしております。

(無題)

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No.695-2 - 2012/07/04 (水) 02:09:13 - cu

２）は厳しいように思いますね。野生株と変異株の比率が1対1であった場合に必ずピークが揃うかというとそうではないと思います。

どの程度の精度で比率を求めたいかにもよりますが、ぱっと考え付く簡単な方法は既にある変異を検出するプライマーでPCR、クローニングして100個くらいコロニーを拾ってシーケンスすればある程度の比はわかるんじゃないですかね。手間はかかりますが、必ず結果は出そうです。ときに変異株は当該欠失がヘテロなのかホモなのかというのも重要なファクターでしょうね。

DNA変異細胞割合の定量的測定

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No.695-1 - 2012/07/03 (火) 02:37:53 - ち

お世話になります。

とある細胞検体で、遺伝子Aの変異株が一定割合混じっているとします。
この変異はDNA２塩基の欠失でフレームシフト変異です。
野生株と変異株の間で、既知の表現形質の差異はありません。
変異部の両側に設計されたプライマーは既に使用しており
（変異部含めて300bpくらい）、
変異そのものの有無はPCR＋シークエンスで定性的に検出できます。

質問は、「どうやったら野生株と変異株の割合を定量的に測定できるか」です。
考えたのは、
１）遺伝子Aに対し、変異部をまたぐプライマーとまたがないものを設計し、
　　リアルタイムPCRをかけて計算（これが本命）。
２）簡便に知りたいなら、シークエンスでの波形ピークの高さを比較し、半定量的に判定
　　（以前、別のラボがプレゼンしているのを見たんですが、本当に正しいのでしょうか？）
３）HRM（立ち上げに時間がかかりそうなので出来れば避けたい。定量的判定が可能か不明）
の３つで、できれば２）で何とかしたい、１）はたぶん可能、３）は避けたい、というところです。

ご経験のある方、アイデアのある方など、ご意見頂ければ幸いです。

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