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インキュベーターの違いによる細胞の増殖の差 トピック削除
No.6962-TOPIC - 2018/05/30 (水) 15:35:31 - aile
4種類のインキュベーターを使用しています。
@今まで何年も使っていたインキュベーター
A最近購入したインキュベーター
B最近購入したインキュベーター
C最近購入したインキュベーター

@とABCの大きさはほぼ同じ
@とABCのメーカーは異なる
ABCについては、メーカー同じ、購入時期は数ヶ月のズレがある程度
(1年も差がない)
ABCは生産されて約2年経つもので、不具合の報告はない(メーカーに確認済)


今後、実験をするにあたり、
@のインキュベーターと変わらず培養できるか試験をしてました。
しかし、@とABCでは差が見られます。

ここのラボでは接着細胞のみを使用しています。

1×10^4cells(6cm dish)以下だと@で問題なく増殖しますが
ABCだと減少します。
(1dishの細胞を用いて、大きなフラスコで混ぜたものをdishに分注して
 複数枚、同時にインキュベーターで培養)

細胞濃度が低くなると減少傾向が強くなります。

例えば、6cm dishに5×10^2播種したとしたら、1週間後には5×10ぐらいになり、
    6cm dishに1×10^4播種したとしたら、1週間後には7×10^3ぐらいになります。
    @のインキュベーターでは、いずれの条件でも全て増加しています。

他の細胞を用いても、同じような結果となります。

培地の色が少し異なるので、CO2濃度が原因の元ではないかとも思っていますが
上司には否定されました。
(@はオレンジ寄り ABCはピンク寄りの色)
CO2濃度がおかしければ、もっと増殖に影響があるはずと。
(pH試験紙を用いると特に大きな差は見られなかった)

湿度を保つための水は、全て同時期に同じ水を用いて入れ替えたので、
水が原因ではないと思っています。


ABCのインキュベーターを用いて、細胞濃度が低い状態で、
数日間培養する実験を行う予定なので、困っています。

何が原因だと考えられるでしょうか。

よろしくお願い致します。
 
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9件 ( 1 〜 9 )  前 | 次  1/ 1. /1


沢山の回答をありがとうございます。 解決済み 削除/引用
No.6962-9 - 2018/05/31 (木) 09:38:28 - aile
皆さんの回答を参考に、
今、ここのラボで出来ることをまとめて上司に掛け合ってみようと思います。

色々な方法を教えていただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.6962-8 - 2018/05/31 (木) 03:22:43 - おお
メーカーの代理店に細胞増えないしなんか変だよと言ったらそれなりのことはやってくれるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用
No.6962-7 - 2018/05/30 (水) 18:21:12 - mon
私は、CO2濃度が原因と思います。
特に細胞密度が低いときの増殖はややpH低めが良いので。
DMEMのオリジナルの処方は8%CO2用ですし。
ATCCの培地の処方は炭酸水素ナトリウム濃度が低めになっていて、DMEMでも5%CO2下でオレンジ色です。一般的なDMEMは赤めですよね。

(無題) 削除/引用
No.6962-6 - 2018/05/30 (水) 17:50:14 - TO
ほかの方も書いているように、何はともあれ温度計・CO2計で測定してすべてのインキュベーターをノーマライズすること。
ただし、温度計・CO2計の方の校正も信頼の置ける方法で取ってあることも必要。市販の科学測定用の温度計でも、表示は0.1℃刻みでも、多くのものは絶対値の誤差は±1℃とあったりする。実際、温度計を複数本用意して測ってみるとそれくらいの誤差があることがわかる。私が絶対値が信頼できる温度計としておすすめなのは体温計。複数メーカーのものを5本くらいもっているが、37℃付近の温度を等しく出してくる。しかし、体温計はオートオフ機能があるのでCO2インキュベーターないに入れてもすぐに切れてしまう。そこで、まずはウォーターバスを使って手持ちの温度計の誤差を把握して、それをもとにCO2インキュベーター内の温度を測定するのがよい。この時、プローブと液晶が別のものを使ってコードを中から出して測るのはお勧めしない。内ドアの隙間があると、内部のファンの撹拌具合が変わる可能性がある。温度表示液晶も内部にある状態で、ぱっと覗くのがいい。
CO2計の方はもっとややこしい。CO2計の校正はメーカーに出して行う。しかし、私のラボで新規CO2インキュベーターを購入した際、CO2インキュベーター会社が持ってきたCO2計とラボで持っていたCO2計で値が結構ずれた。どちらも年に1回のCO2計メーカーによる校正をしているものであるのに…。結局、古いCO2インキュベーターとの整合性からラボのCO2計測定値を基に新CO2インキュベーターのCO2表示校正を行ったが、絶対値として正しい値になっているかは不明のままになっている。
ともかくも、CO2インキュベーター設置時の温度表示・CO2濃度表示のメーカーによる校正は、大なり小なり異なっていると思った方がいい。また
経時変化もあるだろう。どれも細胞が死んだりするほどずれていることはないのでそのままでもいいという方針もあるだろうが、各CO2インキュベーターをノーマライズしたほうが思わぬアーティファクトを生まないためにもいいのは確かだ。

(無題) 削除/引用
No.6962-5 - 2018/05/30 (水) 17:25:50 - おお
温度及びCO2の校正をしたほうがいいでしょう。

細胞なしの培養液を入れたDishを入れておくと細胞の代謝産物の影響によるpHの変動がないのでラフではありますがCO2濃度の違いが見れる可能性はあります。Phenol redがピンクとオレンジでは細胞にとっては結構違うと思います。pH試験紙は結構ラフな測定の部類だと思うのですが、、、

https://en.wikipedia.org/wiki/Phenol_red
ピンクならpH8以上になってるかも、、、

(無題) 削除/引用
No.6962-4 - 2018/05/30 (水) 15:58:44 - TS
変な使い方をした履歴などがないなら(揮発性のものが残っているとか)、
温度かCO2濃度くらいじゃないですか?

インキュベータ付属ではない温度計とCO2濃度計を置いてみて測定してみては?

CO2濃度計とかなければ業者に測ってもらうとか、貸してもらうとか。

(無題) 削除/引用
No.6962-3 - 2018/05/30 (水) 15:57:53 - ゴンタ
まずは、「全ての」インキュベーターに関して、温度及びCO2の校正をした方が良いと思います。その上で、判断すべき事象かなと思います。

(無題) 削除/引用
No.6962-2 - 2018/05/30 (水) 15:52:41 - toto
エアージャケットの場合はウォータージャケットに比べて細胞を置く位置による影響を受けることもありますが、そういう関係でしょうか?培地の色が違うのは細胞増殖との関係もあるので、炭酸ガス濃度を測ればその可能性は排除できますね。ただ新しいのだとまず問題ないはずですが。

インキュベーターの違いによる細胞の増殖の差 削除/引用
No.6962-1 - 2018/05/30 (水) 15:35:31 - aile
4種類のインキュベーターを使用しています。
@今まで何年も使っていたインキュベーター
A最近購入したインキュベーター
B最近購入したインキュベーター
C最近購入したインキュベーター

@とABCの大きさはほぼ同じ
@とABCのメーカーは異なる
ABCについては、メーカー同じ、購入時期は数ヶ月のズレがある程度
(1年も差がない)
ABCは生産されて約2年経つもので、不具合の報告はない(メーカーに確認済)


今後、実験をするにあたり、
@のインキュベーターと変わらず培養できるか試験をしてました。
しかし、@とABCでは差が見られます。

ここのラボでは接着細胞のみを使用しています。

1×10^4cells(6cm dish)以下だと@で問題なく増殖しますが
ABCだと減少します。
(1dishの細胞を用いて、大きなフラスコで混ぜたものをdishに分注して
 複数枚、同時にインキュベーターで培養)

細胞濃度が低くなると減少傾向が強くなります。

例えば、6cm dishに5×10^2播種したとしたら、1週間後には5×10ぐらいになり、
    6cm dishに1×10^4播種したとしたら、1週間後には7×10^3ぐらいになります。
    @のインキュベーターでは、いずれの条件でも全て増加しています。

他の細胞を用いても、同じような結果となります。

培地の色が少し異なるので、CO2濃度が原因の元ではないかとも思っていますが
上司には否定されました。
(@はオレンジ寄り ABCはピンク寄りの色)
CO2濃度がおかしければ、もっと増殖に影響があるはずと。
(pH試験紙を用いると特に大きな差は見られなかった)

湿度を保つための水は、全て同時期に同じ水を用いて入れ替えたので、
水が原因ではないと思っています。


ABCのインキュベーターを用いて、細胞濃度が低い状態で、
数日間培養する実験を行う予定なので、困っています。

何が原因だと考えられるでしょうか。

よろしくお願い致します。

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