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IRES前の遺伝子が発現していないようです。 トピック削除
No.6967-TOPIC - 2018/06/01 (金) 07:09:56 - 愛です
いつも勉強させてもらっています。

今、ゴルジに局在するヒトたんぱく質Zを安定発現するHeLaを樹立する目的で、完全長のZ(ATGからSTOPコドンまで)をIRES-EGFPの前にクローニングしました。プラスミドはレンチウイルス系のものです。

一過性発現(レンチ用プラスミドをリポフェクション)ではZが発現していることが確認されています。
そしてウイルス調製を行い、ZのノックアウトHeLaに感染させ、EGFP陽性細胞をソーティングで得ました。

ソートし終えて4週間経っていますが、EGFPはしっかり発現しています。

ただ残念なことに、Zの発現が認められませんでした。
ZノックアウトHeLaの表現型も回復していませんでした。


IRES後の遺伝子の発現が消失したり極端に低くなるケースは頻出だと思いますが、IRES後の遺伝子が発現しているにも関わらず、前の遺伝子の発現が認められないケースはどういった理由がありますでしょうか?
過去トピックも探しましたが、該当するものがありませんでしたのでトピックを立てました。
どうぞよろしくお願いいたします。
 
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7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


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No.6967-7 - 2018/06/06 (水) 20:15:14 - 思いつき
発現はしているのだけど、その遺伝子(タンパク)が恒常的にプロテアソームもしくはオートファジーによって分解される性質があるとか?

(無題) 削除/引用
No.6967-6 - 2018/06/03 (日) 10:13:28 - おお
レンチでHeLa対象だったらソートせずとも高い感染効率ですぐ使える状態に持っていけるのではと、、、

(無題) 削除/引用
No.6967-5 - 2018/06/03 (日) 07:50:32 - VT
Zの発現レベルは、タンパクだけでなく、mRNAでも確認されてますでしょうか?

一般論として、安定発現より一過性発現の方が、発現量が高いと思われるのですが、EGFPの発現レベルは、一過性と安定発現でどれくらい違いますか? 安定発現細胞でかなり下がっているようなら、Zの検出にも影響するかもしれません。

あと、Zの発現確認は、ソート後どれくらい経ってからでしょうか? ソート直後に確認すれば、培養によるクローン選択の影響を減らすことができるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.6967-4 - 2018/06/01 (金) 13:19:11 - mon
Zの発現量が多くて毒性があり、CDSのmutation・deletion等が生じたクローンのみ生き残ったとか。。
あるいは、ZでERストレス等が惹起されてあっという間に分解されているとか。。

(無題) 削除/引用
No.6967-3 - 2018/06/01 (金) 09:37:46 - 愛です。
AP様、はい、入っています。すみません書き損じました。

(無題) 削除/引用
No.6967-2 - 2018/06/01 (金) 08:46:07 - AP
Kozakは入ってる?

IRES前の遺伝子が発現していないようです。 削除/引用
No.6967-1 - 2018/06/01 (金) 07:09:56 - 愛です
いつも勉強させてもらっています。

今、ゴルジに局在するヒトたんぱく質Zを安定発現するHeLaを樹立する目的で、完全長のZ(ATGからSTOPコドンまで)をIRES-EGFPの前にクローニングしました。プラスミドはレンチウイルス系のものです。

一過性発現(レンチ用プラスミドをリポフェクション)ではZが発現していることが確認されています。
そしてウイルス調製を行い、ZのノックアウトHeLaに感染させ、EGFP陽性細胞をソーティングで得ました。

ソートし終えて4週間経っていますが、EGFPはしっかり発現しています。

ただ残念なことに、Zの発現が認められませんでした。
ZノックアウトHeLaの表現型も回復していませんでした。


IRES後の遺伝子の発現が消失したり極端に低くなるケースは頻出だと思いますが、IRES後の遺伝子が発現しているにも関わらず、前の遺伝子の発現が認められないケースはどういった理由がありますでしょうか?
過去トピックも探しましたが、該当するものがありませんでしたのでトピックを立てました。
どうぞよろしくお願いいたします。

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