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(無題) 削除/引用 No.70-4 - 2012/01/23 (月) 17:52:53 - あああ ＞GFP-タンパク質の局在に必要なドメインの変異体を作成し、その局在がGFPのアーティファクトでないことを示せばいいのでは。 これはやりました。GFPのアーティファクトでないことは示せました。ですがPIから、内在性の抗体がないなら、どうしても小さなタグの染色もやれ、と厳命（？）されてます。。。 変成剤と、タグの位置を変えるのはやってみます。 ＞大量に発現していて、細胞質にも沢山存在する、とかはどうなのでしょう？ はい、おっしゃる通り、過剰発現で細胞質のシグナルが高すぎて膜が見えなくなっている、というのは考えています。 発現量が下がるようにトランスフェクションの条件を変えようかと思っています。 膜に結合しているのは20％くらいなのですが、分画ではGFP融合もFlag融合も同じ位の量が膜に結合していて、Flagで染色されないのは別の理由なのかなと、思っているところです。

(無題) 削除/引用 No.70-3 - 2012/01/23 (月) 13:35:35 - PP ＞細胞分画してウエスタンブロットではFlagタグ付きも一定量が膜に分画されます。 大量に発現していて、細胞質にも沢山存在する、とかはどうなのでしょう？ 一定量って、どういう意味かなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.70-2 - 2012/01/22 (日) 18:10:16 - KY 通常、免疫染色でタンパク質をdenatureするのは、抗体がdenature状態でないと認識できないために、denatureを行うことはあります。 SDS, 還元剤などでdenatureを行う方法はあります。 例えば、 http://jcs.biologists.org/content/112/4/537 あとは、組織切片などで行う、クエン酸やEDTA溶液で熱変性も培養細胞で使えます。 立体構造的に抗体がアクセスできないかどうかは、 やるだけやってみるしかないかな。 むしろN末、Ｃ末タグ両方試してみるほうがいいかも。 それがダメなら、GFP-タンパク質の局在に必要なドメインの変異体を作成し、その局在がGFPのアーティファクトでないことを示せばいいのでは。

HAやFLAGタグ融合の免疫染色 削除/引用 No.70-1 - 2012/01/22 (日) 12:22:14 - あああ 膜に結合能を持つことがわかっている細胞質タンパク質の細胞内の局在を調べています。蛍光タンパク融合体では、細胞質の他、オルガネラや細胞膜への局在が観察できるのですが、FlagやHAタグをつけて免疫染色した場合は細胞質が染まり、膜への局在は観察できせん。 Flag、HAタグとの融合体と蛍光タンパクとの融合体は、どちらもタグ無しと同じように機能することは別のアッセイで確認していて、細胞分画してウエスタンブロットではFlagタグ付きも一定量が膜に分画されます。 複合体を作って膜に局在することがわかっていて、タグが隠れてしまうのかと思っているですが、実際にそういうことはよくあるのでしょうか。　そのタンパクに対する抗体はなく、蛍光タンパク以外に小さなタグでも示すように言われているのですが、固定後、SDS等でタグを出させたりすることはできるでしょうか

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