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新生仔マウス脳の酵素処理 トピック削除
No.7006-TOPIC - 2018/06/15 (金) 08:57:03 - パパイン
マウス脳組織の酵素処理について教えてください。
生後の脳組織を分散後、セルソーターで解析したいと考えています。
新生仔脳組織の分離には一般的にパパインが使われていますが(37℃、30分間)、本処理後に解析を実施すると生細胞集団が僅かで、その他のゴミ(死細胞の断片等?)が多数含まれます。解析に用いた細胞をトリパンブルーで確認すると、細胞の形態をしたものは95%ぐらいの割合で生きていました。
そこで質問ですが、新生仔脳をパパイン処理する場合はある程度細胞のゴミが含まれるものなのでしょうか。実際に胎生期脳組織ではこのようなゴミはほぼ含まれません。セルソーターを使うにしても、このゴミも認識されてしまうので、どうしてもevent数が増加してしまいソーティング効率が悪くなってしまいます。それに可能であればこの細胞のゴミも、酵素処理を調節することで生きた状態に保てたらとも思っています。

(操作方法)
↓脳を取り出して冷やしたPBSで洗浄
↓脳組織をピンセットで取り出し、1mm3角に細断
↓パパイン処理(37℃、30分)
↓酵素反応停止
↓バッファーに置換してソーターで解析

周囲に同様の実験をしている方がいないため本掲示板で質問させていただきました。どうぞよろしくお願いいたします。
 
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No.7006-6 - 2018/06/16 (土) 07:34:33 - パパイン
おお様

ご回答ありがとうございます。
パーコールは使用したことがないのですが、仰る通り、大きさの違いから事前に分離すれば回収率が上がるかもしれません。この点については検討してみてもいいかと考えています。
一方で、パパイン処理で細胞のゴミが増えてしまうのを抑えることは難しいでしょうか?ひとつ懸念しているのは、現在使用しているパパインキットがユニット数非公開のものになります(神経初代培養に最適化されているらしい)。今後、論文等に合わせて10-15ユニットに調整可能なものを検討する予定です。

(無題) 削除/引用
No.7006-5 - 2018/06/16 (土) 07:03:17 - おお
そういう実験はしないので当てスッポですが、更にゴミを除くとしたらパーコールなどを使えば純度が上がるのでは。

(無題) 削除/引用
No.7006-4 - 2018/06/15 (金) 14:50:11 - AA
細胞より小さなゴミであればFSCが小さいのでFACSの邪魔にはなりません。
それらも検出してしまうようであれば、FSCのgating条件を見直したほうがいいと思います

胎児脳は比較的結合組織が少なくソーティングしやすい組織だと思います

(無題) 削除/引用
No.7006-3 - 2018/06/15 (金) 13:20:34 - パパイン
AA様

セルストレーナーは35μmのメッシュサイズを使用しております。
ただ、細胞より小さなゴミもこのサイズを通過できると思うので、根本的な改善方法にはならないのではと思っています。
新生仔脳だと細胞同士もタイトにコネクションしているので、細胞のゴミが多くなるのは仕方がないのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7006-2 - 2018/06/15 (金) 12:39:21 - AA
ストレーナーを通すとかなり改善するはずですが、
どのポアサイズのものを使っていますか?

分散サンプルをストレーナー無しでFACSに通すと詰まりやすくなるのでおすすめしません

新生仔マウス脳の酵素処理 削除/引用
No.7006-1 - 2018/06/15 (金) 08:57:03 - パパイン
マウス脳組織の酵素処理について教えてください。
生後の脳組織を分散後、セルソーターで解析したいと考えています。
新生仔脳組織の分離には一般的にパパインが使われていますが(37℃、30分間)、本処理後に解析を実施すると生細胞集団が僅かで、その他のゴミ(死細胞の断片等?)が多数含まれます。解析に用いた細胞をトリパンブルーで確認すると、細胞の形態をしたものは95%ぐらいの割合で生きていました。
そこで質問ですが、新生仔脳をパパイン処理する場合はある程度細胞のゴミが含まれるものなのでしょうか。実際に胎生期脳組織ではこのようなゴミはほぼ含まれません。セルソーターを使うにしても、このゴミも認識されてしまうので、どうしてもevent数が増加してしまいソーティング効率が悪くなってしまいます。それに可能であればこの細胞のゴミも、酵素処理を調節することで生きた状態に保てたらとも思っています。

(操作方法)
↓脳を取り出して冷やしたPBSで洗浄
↓脳組織をピンセットで取り出し、1mm3角に細断
↓パパイン処理(37℃、30分)
↓酵素反応停止
↓バッファーに置換してソーターで解析

周囲に同様の実験をしている方がいないため本掲示板で質問させていただきました。どうぞよろしくお願いいたします。

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