初めまして。私は日本で修士号を取得し、その後、結婚して主人の留学に帯同しているものです。
今、主人がポスドクをしている研究室にて、テックとして少しだけ実験のお手伝いをさせてもらっています。
この研究室では分子生物学はあまりやっておらず、周りにも相談させていただく環境がないものですから、ここにてご助言をいただければと思い、恐縮ながらトピックを立てさせていただきました。
私自身は修士時代までマウスやヒトセルラインから得られたcDNAを元に、興味の遺伝子をPCRにて単離、プラスミドへの連結、そのプラスミドをセルラインに遺伝子導入、ということを行なって来ています。
こちらに来て、早速9つの遺伝子のプラスミドを作るよう言われたのですが、最初の5つは問題なく作製できましたが、後の4つはPCRがまったくかかりません。アニール温度を必要以下の54度にまで下げても何も得られずです。
私が修士時代のころ、同じような問題が生じたら、EST（？）を買ったらどうですか？ということを当時の教官に提案していただいたことがあります。もう20年も前の話です。
みなさまは遺伝子のPCRがどうしてもうまくかからなかった場合、遺伝子を買う、ということをされたこと、ありますでしょうか？おそらくポリメラーゼを変えたりするというのがよく行われるとは思いますが。。
私はPfu Ultra IIを使っており、遺伝子の大きさはまちまちですが、2600-3750bpまでのものがかかっていません。1100-2500bpまではうまくかかっています。他の酵素は試してはいません。プライマー配列は問題ないです。cDNAはヒト線維芽細胞由来のものと、ヒト胎児由来のものを使用しましたが、いずれもバンドは認められず、ただPCRでバンドを得たい遺伝子は一般的にどのような組織にも存在しているものです。
こちらではOriGeneというところでプラスミドに入った状態の遺伝子が購入できますが、やはり高いです。
できれば、目的の遺伝子がエンリッチされたライブラリーというのでしょうか、そういうものが購入できればそれを元にPCRが容易にできるのではと想像します。あるいは遺伝子が安く購入できればそれに越したことはもちろんありませんが...
ご助言いただけますと幸いです。 |
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