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組織切片上の抗体を検出する方法 トピック削除
No.7016-TOPIC - 2018/06/19 (火) 17:18:51 - sato
組織切片上の抗体を検出したいです。
普通の免疫染色の逆になりますが、出来ますか?
 
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22件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


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No.7016-23 - 2018/06/27 (水) 08:43:10 - sato
ありがとうございます。
大変参考になります。
BALをしたことによって、抗体が出てしまっていたり、動いてしまっていたりしている可能性もあるので(ある程度出ているのは確かですが)BALをしない病態モデルを作ってやり直して見ます。
FITC抗原の経気道投与も考えています。
2か月かかるので、また質問があったらご享受ください。

(無題) 削除/引用
No.7016-22 - 2018/06/26 (火) 17:21:47 - おお
>同じ職場の者から意見をいただいたのですが、組織切片のように、固定された、死んでしまっているような状況下にある抗体に、結合能力はそもそもあるんでしょうか?

まず抗体が固定されたからと言って結合能力がなくなるとは限らないでしょう。ただしそれは固定の程度や周りの環境に大きく左右されるだろうと思いますので結合能力がなくならないと言い切れるものでもないかと思います。

なので何らかの証明が必要かもしれません。FITCでラベルされてない抗原でコンペティションがおこるなら、おそらく特異的な結合をしているだろうといえます(少なくともシグナルがほぼ消失する部分は_)。

間接的な裏とり(サポートしうるデーター)として2次抗体で直接そめ、抗原特異性はともかくそこに抗体があることをしめすのもやっておいたほうがいいかもしれません。抗体のタイプ(たとえばIgGとかそのサブタイプ)がわかっているならそれに特異的なものでもいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.7016-21 - 2018/06/26 (火) 15:58:33 - sato
同じ職場の者から意見をいただいたのですが、組織切片のように、固定された、死んでしまっているような状況下にある抗体に、結合能力はそもそもあるんでしょうか?

先程、全体的に染まってしまったと書きましたが、バックが高いだけ(共染)かとも思いましたが、正常の肺では明らかに染まりが薄いので、共染とも違う気がするし・・・。

染まったけど、なんか腑に落ちません。

(無題) 削除/引用
No.7016-20 - 2018/06/26 (火) 14:30:37 - sato
FITC標識抗原が、組織中の抗体に絶対に付くと信じ、FITC標識抗原の濃度、反応時間、二次抗体(抗FITC抗体)の濃度、反応時間、賦活化の有無、様々な条件を試してみた結果です。
FITC標識抗原なし、あるいは二次抗体なし、の陰性コントロールは全く染まらなかったので、大丈夫だと思っています。

ただ、気管周辺に(出来れば基底膜)局在していて欲しかったのですが、全体的に染まってしまったのが、残念なところです。

(無題) 削除/引用
No.7016-19 - 2018/06/26 (火) 00:12:35 - おお
よかったです。実際どのような工夫があったのかなどフィードバックが聞けるとうれしいです。

(無題) 削除/引用
No.7016-18 - 2018/06/25 (月) 14:31:42 - sato
長い時間、苦労していましたが、抗FITC抗体で目的の抗体を染色することに成功いたしました。
みなさん、いろいろと教えて下さり、ありがとうございました。
またなにかありましたら、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.7016-17 - 2018/06/21 (木) 10:14:41 - おお
>抗体とFITC付抗原の結合がはがれて、
組織にある抗体が剥がれて出てくるかはわかりません。組織にある抗体からあなたの反応させた抗原をリリースできるバッファーが必要でしょう。そういう条件なので、ELISAの固化する場合も工夫が必要かもしれません。固化につかえるもので、抗原抗体複合体を外せそうなものがあればいいですけど。

(無題) 削除/引用
No.7016-16 - 2018/06/21 (木) 09:54:41 - sato
おおさん、大変参考になりました。
ありがとうございます。
組織からFITC付抗原をはがすところからやってみます。
ちなみに、おおさんが教えて下さった方法では、抗体とFITC付抗原の結合がはがれて、FITCと抗原は外れないんですよね?
今のところ、ELISAが一番手っ取り早く着手できる検出法なので、抗原を固相化して、はがしたサンプルを結合させて、抗FITC抗体-HRPで検出してみます。

(無題) 削除/引用
No.7016-15 - 2018/06/21 (木) 09:42:43 - sato
乙さん、ありがとうございます。
組織はマウス肺で、BAL中に抗体が出てくるのをELISAで確認できているので、組織上にも抗原と反応できる形で存在するだろうという見込みだけでやっています。
ですのでplasma cellの確認はしていません。

(無題) 削除/引用
No.7016-14 - 2018/06/21 (木) 04:51:29 - おお
親和性が確認されているなら一度組織上にくっついているか確認するのも手かと思います。方法論を前回の質問で聞いていたかと思いますが、異種で親和性が疑われていたということなので方法論的には答えませんでした。

まず組織をそめる。染めた組織からついているであろうFITCラベルした抗原をはがす。変性作用のあるバッファーを一滴ほど垂らしで数分後に回収。もう一度かけて、スライド表面をちっさなマイナスドライバーの先みたいなのでゴリゴリ引っ掻いて見てもいいでしょう。そしてバッファーを回収する。回収したものをスロットブロット、(抗原が蛋白なら)WB、ELISAなどで検出するといった具合です。定量性にはかけるでしょうけど、ネガコンより常に高いならのぞみありかと。(自家蛍光のバックグランドが高くってついていシグナルを識別できないという前提です)

もしある程度組織上にあなたのプローブがついていることが確認できるなら、Tyramide Signal Amplificationというものもあります。バックグランドの低い領域の色を選び使ってみてもいいかもしれません。

https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/ultrasensitive-detection-technology/tyramide-signal-amplification-technology.html

(無題) 削除/引用
No.7016-13 - 2018/06/21 (木) 03:04:47 - 乙
抗体の沈着してる組織にplasma cellいる?(てかCD138?とかで免疫染色するとかした?)  もしいればIgの遺伝子クローニング可変領域のアミノ酸配列getしてそれに対する特異抗体作ればantibody to そのautoantibodyがゲトできる。つまりイディオタイプ抗体を自分でつくるみたいなのりで。素人の思いつきだけどなんかだれかやってそうな気がするのでそういうのやってるひといるかどうかしらべていたらやればいいかもとかおもうけどできるかどうかはわからないけど。

(無題) 削除/引用
No.7016-12 - 2018/06/20 (水) 09:55:41 - sato
覚えていてくださったんですか!
回答がなくなったので、済みにしました。

あれから色々やってみて、異種の抗原でも交差することはELISAで確かめられました。
RIは施設的に無理だし、蛍光も自家蛍光が強くてダメなので、抗FITC抗体を買ってみたんですけど。

組織上ではやっぱり付いてないのかな・・・。

(無題) 削除/引用
No.7016-11 - 2018/06/20 (水) 09:33:04 - おお
RIラベル
ゴールドパーティクルラベルで電顕でみる。

なんだっけ、異種の抗原でやって、どうやら親和性が疑われていたんじゃなかったっけ。

(無題) 削除/引用
No.7016-10 - 2018/06/20 (水) 09:00:35 - sato
FITCを付けてやってみましたが、自家蛍光に負けたのか、そもそも付いてないのか、ネガコンと変わりなかったです。
自家蛍光強いです。
さらに抗FITC抗体-HRPで免染もしましたが、ダメでした。
他に方法ないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7016-9 - 2018/06/20 (水) 07:45:30 - おお
じゃあそれにラベル入れればいいじゃん。

(無題) 削除/引用
No.7016-8 - 2018/06/20 (水) 05:11:54 - sato
抗原はもちろん生体内物質で、分かっています。

(無題) 削除/引用
No.7016-7 - 2018/06/19 (火) 23:23:14 - おお
抗体のターゲット分子がわかっているなら方法論はありそうですが、、、

(無題) 削除/引用
No.7016-6 - 2018/06/19 (火) 21:21:58 - sato
みなさん、ご回答ありがとうございます。
えっと・・・検出したいのは正常な状態では存在しないような、自己免疫的な抗体なんですが、それだと対象動物に対する2次抗体とかは、目的の抗体だけに付くわけではないのでダメですよね?

(無題) 削除/引用
No.7016-5 - 2018/06/19 (火) 19:21:32 - wsでfrろp;
使う抗体は標識イムノグロブリン抗体ただ1つというだけで、あとはやることは普通の免疫染色と同じですが、血液が残存してると何か意味があって抗体がそこにあるのか、単に組織に血が残っててそれで抗体が検出されただけなのかが区別がつかないので、PBS等による灌流and臓器の十分な洗浄をして血液を完全に除去することは重要です。特に高感度検出だとよく洗ったつもりでも出たりします。
そういうこともあるので、コントロールの組織(対応する正常組織等、抗体沈着がないであろうサンプル)との対比は必ずしてください。

(無題) 削除/引用
No.7016-4 - 2018/06/19 (火) 18:07:33 - おお
いきなり対象の動物に対する2次抗体を使えばいいという発想がでないのか、、、
ただ、抗体っていろいろあるんだけど、どれよ。


http://www.abcam.com/protocols/mouse-on-mouse-staining-protocol
Much of the background is caused by secondary antibody binding to endogenous mouse IgG in the tissue being stained, and to Fc receptors on B cells, plasma cells and macrophages.

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