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(無題) 削除/引用 No.7021-13 - 2018/06/22 (金) 18:08:55 - MKK １ラウンド目の産物をチップでついて２ラウンド目のPCRを行い、結果として十分量の産物を得ることができました。皆様、貴重なご意見を有難うございました。 ＞cDNAさん PCRチューブの厚さも関係してくるのですね…知りませんでした。 ＞おおさん タッチダウンPCRについての解説を有難うございました。よく理解できました。

(無題) 削除/引用 No.7021-12 - 2018/06/21 (木) 18:58:13 - おお ＞タッチダウンPCRというのは、本来のアニーリング温度より高いところから始めて、本来のアニーリング温度までステップダウン アニーリング温度より高いというのは理想的ですけど、特異性を担保するために効率は悪いだろうけど厳しい条件になる温度で、ある程度増えるのを期待して、徐々に温度を下げていくわけです。PCRフラグメントの量が増えるほどのんすぺとの競合に打ち勝つようになるので、ある程度ふえるとアニーリング温度より下がっても増えるようになります。

(無題) 削除/引用 No.7021-11 - 2018/06/21 (木) 18:25:25 - cDNA シークエンスが目的という事なので、よく増えるプライマーを探した方が速いと思います。研究室によって事情は違いますので、難しいかもしれませんが。 個人的には同じプライマーで2回目でうまく行った試しがないため、2回目を考えるならNested PCRを強くお勧めします。 また、Tmが高いというのであればその領域はGCリッチなのではないでしょうか。もし、ラボでGCリッチな遺伝子を増やしている人が居なければ、他の人の助言があてにならない場合も多々あります。 例えば、98度10秒だって、PCRチューブの厚さによっては意味が変わってきますし、ラボのほとんどの人がそれで増える場合でも、98度15秒との差が大きく出る場合も珍しくありません。

(無題) 削除/引用 No.7021-10 - 2018/06/21 (木) 18:00:56 - MKK ＞APさん バンドをチップで刺すだけで使えるのですね！一度やってみようと思います。有難うございます。 ＞おおさん ゲルからの抽出法、タッチダウンの条件、そのほかの選択肢についてたくさんご意見下さり有難うございます。条件を変えて試す間に、プライマーの再設計はしておきます。 タッチダウンPCRというのは、本来のアニーリング温度より高いところから始めて、本来のアニーリング温度までステップダウンしていくものかと思っていますた…参考にさせていただきます。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.7021-9 - 2018/06/21 (木) 04:19:26 - おお >電気泳動する前のサンプルを使って２ラウンド目のPCRをかけることも可能でしょうか？ ノンスペが出ている以上切り出しをしたほうがいいでしょう。 前後にノンスペがない限り、多少周辺を余裕を持って切り取ってもいいとは思います。数チューブPCRにかけて、エタ沈などで回収して泳動にかけるというてもありますしAPさんがおっしゃるように切り取ったゲルから染み出したものをPCRにかけるくらいでも十分です。そういった場合私なら一旦ゲルを凍結して、遠心機でMaxで１０分間ぐらい回して上清を数マイクロLとるぐらいでやるかもしれません。 タッチダウンについては若干プライマーのTmが高そうなのでやりにくいですが、ベタインなどを加えて反応液で条件を厳しくなるようにしておいて（オリジナルのバッファーなどに入ってなければ）、７２度で５サイクルぐらい、それからサイクルおきに温度を下げていき最終的には６０度ぐらいまで下げていくぐらいでいいかと。で全部で３０から３５サイクルかな。またテンプレートの量を下げたほうがいいことは結構あります。四分 の一とか。 アニーリング温度は一度低めの設定でやるのも手かもと思います。ただし他の設定を少しキツめにしたいかなと。変性時間を長めに取る。アニーリングの時間を長めに取る（２ステップでないなら）。目的のバンドより小さいものがノンスペででるなら伸長反応時間も1.5倍ぐらい長くする。 酵素を変えるのも選択肢ですが、PrimeSTARあたりの世代の酵素はよいとききます。 その他やれそうなことは手の混んだことを含めいくらかありそうですが、あれこれやって結局バンドが増えないで時間だけ経っていく可能性はあるので、プライマーデザインをやり直して、最悪そのプライマーセットでもあまり良くないなら今のプライマーセットの一方などを使ってネストでPCRするというストラテジーを考えれます。

(無題) 削除/引用 No.7021-8 - 2018/06/21 (木) 00:56:00 - AP >その場合ゲルから抽出した産物を使うのが一般的でしょうか？UVを当てて目で見てもバンドが薄いため、うまく切り取れるか不安です ピペットチップをバンドの刺して、新しいPCR反応液に突っ込むくらいでも出来る。

(無題) 削除/引用 No.7021-7 - 2018/06/20 (水) 19:59:34 - MKK ＞APさん ご意見有難うございます。 ある配列を挿入し、上流の挿入部位は普通に増幅→シーケンスできたのですが、下流の挿入部位で難渋している状態です。primerの再設計も検討してみます！

(無題) 削除/引用 No.7021-6 - 2018/06/20 (水) 19:38:54 - AP まあ、2ラウンドかけるという手もないことはないし、nested PCRという手もある。 ゲノムからのPCRならそんなに難しくないはずなのにしっかり増えないというのがまず問題。2ラウンドのPCRとか小手先のことじゃなくて、まずどうしてうまくいかないのか考える方がいいと思う。そうやって、増えないものを小手先で増やそうとしてもやっぱり増えなかったり、標的外の配列に取って代わられてしまったり、いいことない。 どうしてうまくいかないと考えている？ おなじゲノムDNAのプレパーレーションでほかの標的のPCRはちゃんとかかる？ かからないのだったら、ゲノムDNAのプレップに問題があるんだろう。 そこには問題がないとしたら、 多くの場合、こういう問題はプライマーを設計し直すのが一番効果的で早道だったりする。　おなじ2ラウンドのPCRをかけるにしてもnested PCRできるように異なるプライマーセットを持っていた方がいいし。

(無題) 削除/引用 No.7021-5 - 2018/06/20 (水) 19:35:35 - MKK ＞おおさん タッチダウンPCRは経験がありません。 現在、primerのアニーリング温度が72℃ということで、 融解　98℃　10秒 アニーリング＋伸長　72℃　2分(目的産物=1.5Kb)　x35サイクル という2ステップの条件にしています。特異的なバンドは出るのですが、それより小さな非特異的バンドも多い状況です。 タッチダウンPCRを試すなら、「アニーリング温度を75℃→72℃まで1℃/サイクルずつ下げていく」という方法であっていますか？

(無題) 削除/引用 No.7021-4 - 2018/06/20 (水) 19:01:43 - おお タッチダウンとか試した？

(無題) 削除/引用 No.7021-3 - 2018/06/20 (水) 18:47:40 - MKK >閾値さん わざわざゲルから抽出しなくても良いのですね！「一部を電気泳動に‥」というのも参考になりました。ご意見有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.7021-2 - 2018/06/20 (水) 18:37:02 - 閾値 当方の場合ですが、例えば1ラウンド目のPCR product 10ulの内3ulを電気泳動へ、残り7ulを2ラウンド目のPCR templateとして使用することはたまにあります。 電気泳動の際のバンドの濃さを確認してから、templateをそのまま用いるか、希釈して用いるかを決めてます。 ご参考ください。

2ラウンド目のPCR 削除/引用 No.7021-1 - 2018/06/20 (水) 18:23:01 - MKK 遺伝子編集した細胞のシーケンスを目的として、primerを設計してPCRを行っています。電気泳動すると特異的なバンドは検出できるのですが、非常に薄いバンドで、シーケンスに十分量の産物が回収できず困っています。（PCRの条件を色々変えましたが、改善はありませんでした） １ラウンド目のPCR産物を使ってもう一度PCRをかければ上手くいくこともある聞いたのですが、その場合ゲルから抽出した産物を使うのが一般的でしょうか？ UVを当てて目で見てもバンドが薄いため、うまく切り取れるか不安です…その場合は、電気泳動する前のサンプルを使って２ラウンド目のPCRをかけることも可能でしょうか？

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