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消化器からのRNA抽出・RT-PCR トピック削除
No.7045-TOPIC - 2018/06/30 (土) 16:50:17 - tu
マウスから脾臓や消化器(小腸)を採取し、total RNAを抽出、cDNAに逆転写を行い、RT-PCRで遺伝子発現を定量しています。

今回、脾臓や小腸を使ってハウスキーピング遺伝子をいくつか(18s、GAPDH、b-actin)を測定してみたところ、Ct値にかなりばらつきがあり、困っております。

調べてみると脾臓や腸はRNaseが多いようで、それが影響しているのかな?と考えております。腸は一応、サンプリングの際に糞便をPBSで洗浄していますが、完全に洗浄できているかと言われると自信がありません。

抽出したtotal RNAの純度は260/280が2程度で問題ありません。肝臓や脂肪や筋肉などでは問題なくPCRで定量できているので手技的な問題ではなく、サンプリングかそもそもの抽出の仕方が間違っているかもしれません。

RNeasy Mini Kitを使ってRNAを抽出しています。

皆様は脾臓や消化器からRNAを抽出する際にどのようにやっておられますでしょうか。Rnase Inhibitorなどを使った方がよいのでしょうか。

宜しくお願いします。
 
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No.7045-11 - 2018/07/16 (月) 14:06:16 - 1
胃や腸からRNAをとろうとしてもいつも激しく分解していて結局断念した経験があります。どうしたらいいのかはぜひ知りたいところです。
まずは、分解しても当然ながらUV吸光はきれいなままですので、とにかく泳動で確認すべきでしょう。

(無題) 削除/引用
No.7045-10 - 2018/07/06 (金) 07:58:29 - り
小腸は、十二指腸から回腸末端まで、マウスでも結構長いですので、どこをサンプルするかで、多少変わるかもしれません。腸管の場合、腸上皮以外にも粘膜下層から固有筋層、漿膜と、雑多な細胞からできています。パイエル板のような、リンパ球の集まりも場所によっては混在します。サンプルによって構成細胞の比率が異なるならば、マーカー遺伝子発現パターンも変わるかもしれません。腸上皮細胞を分離して使ったりしてますでしょうか?

群平均で2倍程度の差(増幅効率に問題なければ)が見られるとの事ですが、その差が各種マーカーで一致して見られる(例えば、18Sが2倍の群では、GAPDHやactinも2倍になる)のか、マーカーによって挙動が異なるのか、によって解釈が変わるように思います。

一致しているなら、サンプリングに起因する可能性を考えますが、挙動が異なるなら群間での差を見ている可能性はどうでしょう? ノックアウトや長期薬剤刺激により、ハウスキーピング遺伝子であっても影響を受ける可能性はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.7045-9 - 2018/07/02 (月) 09:05:18 - TS
各種消化管、脾臓やっています。
RNA laterに浸漬してから、RNA抽出しています(スピンカラム系、Trizol系)。
定量PCR、マイクロアレイ程度であれば特に問題出ていません。

(無題) 削除/引用
No.7045-8 - 2018/06/30 (土) 21:08:45 - おお
RNAがこわれてないかは電気泳動でラフにチェックできるし、バイオアナライザーなんかを使っている人もいると思うのだけど。

(無題) 削除/引用
No.7045-7 - 2018/06/30 (土) 21:07:31 - おお
RNAlaterっていうのがあるけど最近はあまりつかわないのかなぁ

(無題) 削除/引用
No.7045-6 - 2018/06/30 (土) 21:06:57 - AP
多分、PBS洗浄の出来不出来は関係ないかな。

それと、増幅効率(増幅線の傾き)はそろってそうですか?

(無題) 削除/引用
No.7045-5 - 2018/06/30 (土) 21:00:55 - AP
組織片の大きさ、ホモジナイズの方法、所要時間などは?

(無題) 削除/引用
No.7045-4 - 2018/06/30 (土) 20:29:34 - tu
切除した後、PBSで腸管を洗浄、脾臓はPBSで軽く周りを流してチューブに入れ、液体窒素で凍結、そのまま-80℃のフリーザーへ保存してます。
頸椎脱臼で安楽死させた後、凍結まで最大10〜15分ほどかかっています。
ホモジナイズする際は-20℃の冷凍庫に入れた後、そこから凍結したままlysis bufferでホモジナイズしています。

(無題) 削除/引用
No.7045-3 - 2018/06/30 (土) 19:40:43 - AP
解剖してから検体をホモジナイズするまでの手順は?
lysis bufferでホモジナイズしたあとは、いかにRNase活性が高い検体でもセーフなはず。

(無題) 削除/引用
No.7045-2 - 2018/06/30 (土) 17:09:41 - tu
補足ですが、3群で比較しており、群の平均Ct値が最大で1ほど群の間で差があります。
自分ではやり直した方がいいと思いますがこの程度なら進めるという方はいますでしょうか。

消化器からのRNA抽出・RT-PCR 削除/引用
No.7045-1 - 2018/06/30 (土) 16:50:17 - tu
マウスから脾臓や消化器(小腸)を採取し、total RNAを抽出、cDNAに逆転写を行い、RT-PCRで遺伝子発現を定量しています。

今回、脾臓や小腸を使ってハウスキーピング遺伝子をいくつか(18s、GAPDH、b-actin)を測定してみたところ、Ct値にかなりばらつきがあり、困っております。

調べてみると脾臓や腸はRNaseが多いようで、それが影響しているのかな?と考えております。腸は一応、サンプリングの際に糞便をPBSで洗浄していますが、完全に洗浄できているかと言われると自信がありません。

抽出したtotal RNAの純度は260/280が2程度で問題ありません。肝臓や脂肪や筋肉などでは問題なくPCRで定量できているので手技的な問題ではなく、サンプリングかそもそもの抽出の仕方が間違っているかもしれません。

RNeasy Mini Kitを使ってRNAを抽出しています。

皆様は脾臓や消化器からRNAを抽出する際にどのようにやっておられますでしょうか。Rnase Inhibitorなどを使った方がよいのでしょうか。

宜しくお願いします。

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