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293T トピック削除
No.7055-TOPIC - 2018/07/06 (金) 09:43:58 - ゆみ

お世話になります

現在レンチウイルスを使って、細胞に遺伝子を強制発現させています。
Lenti-X 293T細胞でウイルスを作成し、別のLenti-X 293T細胞に感染させ、タイターを計測するとタイターがとても低いです。タイターの計測はFACSで行っています。
今まで研究室でレンチウイルスをうまく使えた人がおらず、先輩の実験ノートをたどると、タイターの計測はしていないものの感染効率はとても低かったようでした。研究室にある細胞のストックがおかしいのではないかと考えて、一番最初のストックまでノートをたどると、別の研究室から譲ってもらったLenti-X 293T細胞を起こしたものが一番最初でした。その際起こしてから4日ほど大部分の細胞が接着せず、接着したものを継代すると次第に増殖するようになったとのことでした。細胞を譲ってもらった研究室の方では問題なく使えているとのことでした。
Lenti-X 293T細胞を起こしたときにこのようなことは起きるのでしょうか?
また細胞が正常かどうかを知る方法というのはありますでしょうか?ネット上で見られる293T細胞の写真とはそこまで形態的に差はないように見えます。
自分のウイルス回収方法がまずいのか、ベクターがおかしいのか色々疑うところはあると思いますが、まず細胞の方がどうなのかを知りたいです。
宜しくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.7055-5 - 2018/07/07 (土) 13:28:40 - 123
濃縮しているということとPEG沈できているということの確認でした。

(無題) 削除/引用
No.7055-4 - 2018/07/07 (土) 12:57:27 - ゆみ

おお さん 123 さん ありがとうございます

おお さん
新しく細胞を譲っていただけたのでその細胞と自分のストックとでタイターを
比較してみます。

123 さん
PEGで濃縮して遠心すると白いペレットは見えています。
ただ回によってペレットの大きさが少し違うような気がします。
このペレットはウイルスそのものというより血清中のタンパク質が
沈殿してできていると思っていたので、私はあまり大きさを気にしていなかったのですが、ペレットの大きさはウイルスのタイターと関係するのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.7055-3 - 2018/07/06 (金) 22:20:40 - 123
うちのLentiX293も起こしたときsphereっぽくなるけど1回継代すれば293っぽくなります。またvirusも作ります。PEGで濃縮したときペレット見えますか?

(無題) 削除/引用
No.7055-2 - 2018/07/06 (金) 10:12:20 - おお

感覚的に思っていますが、ウイルス産生のときのトランスフェクションがきっちりとワークしている状況でタイターが低いと細胞がおかしいと言えるのだと思います。「ウイルス産生のときのトランスフェクションがきっちりとワークしている」というのはいい細胞できっちりとウイルスができる条件で、その条件で使っている細胞のトランスフェクションの効率が悪いなら、細胞が悪いということ。

複数の要因が結果に影響を受けますので、ちゃんとワークしている部分がないとどれが原因か結論がでなくなってしまいます。

とは言っても今の状況では判断できないのでワークしている細胞をきちっと手に入れるところから始めるほうがいいかと思います。

>起こしてから4日ほど大部分の細胞が接着せず、接着したものを継代すると次第に増殖する
これは保存状態が悪かったからで、このとき細胞の性質が変になった可能性は否めません。譲ってもらったところにもう一度お願いできれば原因の究明がやりやすいと思います。

多分ご存知だと思いますが、あまり継代を続けないほうがいいのである程度細胞を増やして凍結しておいて、実験を始めるときにその凍結したストックから使うようにするべきかと。

293T 削除/引用
No.7055-1 - 2018/07/06 (金) 09:43:58 - ゆみ

お世話になります

現在レンチウイルスを使って、細胞に遺伝子を強制発現させています。
Lenti-X 293T細胞でウイルスを作成し、別のLenti-X 293T細胞に感染させ、タイターを計測するとタイターがとても低いです。タイターの計測はFACSで行っています。
今まで研究室でレンチウイルスをうまく使えた人がおらず、先輩の実験ノートをたどると、タイターの計測はしていないものの感染効率はとても低かったようでした。研究室にある細胞のストックがおかしいのではないかと考えて、一番最初のストックまでノートをたどると、別の研究室から譲ってもらったLenti-X 293T細胞を起こしたものが一番最初でした。その際起こしてから4日ほど大部分の細胞が接着せず、接着したものを継代すると次第に増殖するようになったとのことでした。細胞を譲ってもらった研究室の方では問題なく使えているとのことでした。
Lenti-X 293T細胞を起こしたときにこのようなことは起きるのでしょうか?
また細胞が正常かどうかを知る方法というのはありますでしょうか?ネット上で見られる293T細胞の写真とはそこまで形態的に差はないように見えます。
自分のウイルス回収方法がまずいのか、ベクターがおかしいのか色々疑うところはあると思いますが、まず細胞の方がどうなのかを知りたいです。
宜しくお願いします。

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