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ピントが合わない 削除/引用 No.7086-16 - 2021/06/03 (木) 15:39:34 - ぽよよ 免疫染色を普段から行っているのですが、蛍光顕微鏡で観察するときに困っていることがあります。 うまく封入されていないのか、ピントを少し変えれば蛍光が見える細胞があったり、ピントを調節してもずっとぼやけている細胞があったりします。タンパク質の局在をサンプルごとに調べているため、このままでは集めたデータにズレが出てくるので困っています。 封入の際には、スライドグラスに封入剤を垂らし、カバーガラスを乗せ、ひっくり返して上から押しつける作業を行っています。 押し付けが足りないから細胞によってピントがずれるのかなと思っています。 何か良い方法がございましたらご教授いただけると幸いです。よろしくお願い致します

(無題) 削除/引用 No.7086-15 - 2019/09/21 (土) 20:26:11 - 染物屋本店 聞いた話ですがカバーガラスの上に10円玉を１枚置くと良いらしいです。

(無題) 削除/引用 No.7086-14 - 2019/09/19 (木) 19:18:25 - ;alsekhf 元質問主の方に念のため確認ですが、封入前にサンプルが乾いたりしていませんよね？

(無題) 削除/引用 No.7086-13 - 2019/09/18 (水) 14:18:52 - AA 封入剤はメーカーによってだいぶ特性が違う気がします。 コメント出てますが、具体的な封入剤に合わせた対応が大事だと思います。 昔Slowfadeを使ったときは、何をどうしても気泡が消えませんでした。 (その後、Fluoromountに変えたら問題が解決した) 手技的な面では、ガラス/封入剤の乗せ方が一番だと思いますが、 見落としがちな面では、切片の厚みに合わせた量の封入剤を入れたほうがいいです 特に厚めの切片、100um等、の場合、カバーグラスが持ち上がるのか、 余分な封入剤をキムワイプなどで吸わせるとその分が後で気泡が入ることがあります。 この辺は、硬化する糊が入っているかどうかにもよるとは思いますが。 便乗質問の方のケースですが、 キシレンで変な汚れがついた場合は、拭き取るのはたいがいしんどいので キシレン中にスライドガラスごと沈めて、カバーガラスを外してしまうのがいいです。 油性封入剤ならキシレンで溶けると思います。 取れたら次は気をつけて封入してください

ニッスル染色　封入時のカバーガラスの汚れ 削除/引用 No.7086-12 - 2019/09/13 (金) 14:33:56 - 学部生 ニッスル染色を行っている学部生のものです。 封入時にキシレンが手袋についたまま、気泡を追い出すためカバーガラスを押したら、カバーガラスにキシレンがしまいました。 ひどいものだと顕微鏡で観察したときに黒く映ってしまい、うまく観察できません。 キシレンで表面を拭いても白い汚れが広がるだけで、観察がうまくできません。 なにかいい手段があれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.7086-11 - 2018/07/21 (土) 11:11:33 - Ano 質問者はどこのメーカーのどの商品を使ってるのでしょうか？ 検討違いのやりとりになってなきゃ良いけど

(無題) 削除/引用 No.7086-10 - 2018/07/21 (土) 10:28:58 - 水の泡 AAさん ありがとうございます。何か適当な重しを見つけて試してみます。

(無題) 削除/引用 No.7086-9 - 2018/07/20 (金) 15:48:12 - AA 切片が厚くてどうしても泡が入るときは、封入剤が固くなるまでの間に、 カバーグラスの上に重し(直径1cmくらいの金属ボルトなど) を載せて泡が切片上に来ないようにしたりしてます。

(無題) 削除/引用 No.7086-8 - 2018/07/20 (金) 00:45:47 - 水の泡 APさん　MMさん ありがとうございます。置いたカバーガラスに、スライドガラスを近づける方法を是非次回試させていただこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.7086-7 - 2018/07/20 (金) 00:08:26 - MM 私もAPさんと同じような方法でやっています。 テーブルにワイプを置いて、その上にカバーグラスを置く 長方形のカバーグラスの底辺？あたりに封入剤を乗せる（私は底辺に一を書くようにのせてます。） スライドグラスを垂直に立てて、ゆっくりパタンとかぶせるように倒す ひっくり返すと完成 脇から封入剤がちょっと漏れるときはふき取ります。カバーグラスが気持ち大きめだといいかもしれません。 封入剤は室温に戻してます。 You Tubeの動画でもいろいろな手技がアップされていて参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.7086-6 - 2018/07/19 (木) 22:43:40 - AP これ試してみて、 >カバーグラスを手頃な台(カバーグラスの箱くらいの)に乗せて封入剤を適量垂らす。 そこにスライドグラスのモノが乗っている部分を近づけていく。封入剤に触れると表面張力でカバーグラスが吸い付く。 カバーグラスが吸い付きながら封入剤が一点から放射状に広がるので気泡が入りにくい。

(無題) 削除/引用 No.7086-5 - 2018/07/19 (木) 22:29:04 - 水の泡 皆様 いろいろとご意見ありがとうございます。 室温に戻すかどうか、意見の分かれるところではありそうですが、すぐに試せることなので、試してみたいと思います。室温に戻すとすると、封入後、ある程度固化するまではスライドは室温に置いておいた方が良いのでしょうか？ かるく遠心さんの、遠心するというご意見はあり、だと思います。（最近、使用頻度が高いので、知らない間に細かい泡を発生させてしまっていたかもしれません）分注、遠心も次回試してみたいと思います。 ところで皆さんはカバーガラスを載せた後は気泡を押し出しておられますか？ せっかくそーっとカバーガラスを載せても、その後にカバーガラスを押す時に、封入剤の急な流れ？組織周辺での攪拌？を作ってしまい、それが逆に新たに気泡を作ったり、元ある気泡を細かく散逸させてしまったりして、悪影響を及ぼしているのでは？？と思ってしまう様な時もあるのですが。（とはいえ、この事象も一定しておらず、押し出さないとそれはそれで気泡が残ることもありそうで、どちらがいいのか判断がつきかねています）

(無題) 削除/引用 No.7086-4 - 2018/07/19 (木) 18:32:38 - Ano Vectashieldを使ってますが、 冷蔵保存したのを室温に戻すことなく、すぐに使っていて そんなに問題にならないです。 蓋の内側にスポイト付いてて、切片に1、2滴落とし、カバーグラスを落とすだけです。 粘性あるから室温に戻さない方が良いと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.7086-3 - 2018/07/19 (木) 16:58:24 - かるく遠心 封入剤をラボ内で使用する回数が増えた時に（チップを何度も入れることで）、気泡が蓄積したのではと思ったことがありました。やはり、封入時には気を付けて見ていてもわからず、鏡検してがっくりしておりました。封入剤を小分けしたチューブを室温に戻して、使用前に軽く遠心することで、小さな気泡が取り除けた経験があります。邪道かもしれませんが･･･

(無題) 削除/引用 No.7086-2 - 2018/07/19 (木) 11:26:55 - AP 封入剤は冷蔵保存している場合、室温に平衡化してから使う(温まるとガスが放出されて気泡ができる)。 カバーグラスを手頃な台(カバーグラスの箱くらいの)に乗せて封入剤を適量垂らす。 そこにスライドグラスのモノが乗っている部分を近づけていく。封入剤に触れると表面張力でカバーグラスが吸い付く。

カバーガラスで封入時の泡混入対策 削除/引用 No.7086-1 - 2018/07/19 (木) 09:28:15 - 水の泡 免疫染色の後、最後に封入剤をのせ、カバーガラスをかぶせるステップでどうしても気泡が混入してしまいます。 もともと免疫染色は以前から度々行っており、できるだけカバーグラスをゆっくりかぶせたり、チップの裏で泡を押し出す様にしたり、逆にカバーガラスをそっと載せるだけで敢えて押し付け操作をしないようにしたり、その時々でいろいろと試したりはしているのですが、泡が全くないきれいなスライドをうまく作れません。（肉眼でみると泡がきれいに抜けたように見えても、顕微鏡でみるとどうしても細かい泡がところどころに残っています） 普段の実験では泡のない視野を観察・撮影したり、小さな泡は許容するなどで問題なく対応はできるのですが、ここぞといういい写真を撮りたいと思った時、せっかくのいい視野でも泡が邪魔で時間をかけて他の視野を探す羽目になったり、最悪一から染色をし直したりと、不毛な時間を費やすことも時々あり皆さんに泡を混入させないコツをお伺いしたく投稿しました。 今現在よくやっているのは凍結ブロックを使った蛍光免疫染色で、封入剤は冷蔵保存された褪色防止剤入りのものを使っています。使用前に封入剤は5−10分ほど室温で静置してから使っているのですが、もともと冷蔵保存ということもあり、完全に室温にまでは戻していません。 過去ログを見直して気づいたことですが、封入剤を室温まで温めてから使うべきでしょうか？ また、封入後カバーガラスを押して気泡を押し出すべきなのでしょうか？この時の操作で泡を発生させている様な気がする時もあり、迷っています。 何か良い方法がありましたらお教えください。よろしくお願いいたします。

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