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(無題) 削除/引用 No.7094-6 - 2018/07/23 (月) 10:08:21 - qqq >数ミリメートル単位の断片が肉眼で見えるレベルでずっと残り続ける それは「容易に分解」してないですよ。 鏡検でダマがある、じゃなくて肉眼で、しかも数ミリって。 トリプシン処理後はスクレーパーで掻き取ってますか、ピペッティングしながら回収してますか？ ピペッティングしながらやれば大体分散するはずなので、そうするとやっぱり遠心が強すぎるだろうから、おおさんのおっしゃっている通り、gに直すとどれくらいになっているか確かめた方が良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.7094-5 - 2018/07/22 (日) 23:33:03 - anonymous みなさん返信ありがとうございます。 ＞Trackerさん Trypsin処理についてはPBS(-)でwashののち5min、37℃でincubateしてます。5minは今扱ってる細胞に対するtrypsin処理の時間としては最小限に近い時間なので確かに甘い可能性はありますね。ペレットの分散について少しわかりづらい書き方をしてしまったので申し訳ありません。ペレット自体は数回のピペッティングで容易に分解しますが、分解した結果できた数ミリメートル単位の断片が肉眼で見えるレベルでずっと残り続けるという状態です。 ＞おおさん 確かに懸濁液を保存液に置換する前にタッピングなどで緩めておくのは一つの手ですね。保存液を加えたあとにピペッティングした以上にタッピングなどをすると生存率が低下しそうな気がしますが、そこまで神経質になるほど大きな影響はないのかもしれませんね。（もちろん乱暴に泡立つぐらいやるのはよくないと思いますが）

(無題) 削除/引用 No.7094-4 - 2018/07/22 (日) 07:48:44 - Tracker Trypsinの処理が甘くて細胞間の接着が結構残ってるんじゃないですかね 普通はそんなに強くピペッティングしなくとも数回で分散すると思います

(無題) 削除/引用 No.7094-3 - 2018/07/22 (日) 05:37:30 - おお そんなにペレットがけんだくしにくいって何かちょっと不思議なきがするけど、、、 遠心は６００ｇで５分から１０分で十分かと思いますが、1000rpm 3minで落ちてくるとするとｇでは結構強いのかもしれません。 Tipみたいなのをかくと、 遠心して、上清をとったあと、ペレットをたっぴんぐなどでゆるめておく。保存液を加えて後もたっぴんぐか弱いボルテックスでけんだくを促進させる。 分注の際にぴペッティングする。 と段階を経るとやりやすくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7094-2 - 2018/07/21 (土) 21:17:53 - anonymous 補足ですが遠心は1000rpm 3minで行っています。以前は1000rpm 5minでやっていてそのときに比べると再懸濁しやすくなったように感じますが、10〜20回ピペッティングしたぐらいではやはり小さなペレットが肉眼で見える状態で残ったままです。

細胞ストックをとる際の細胞ペレットの再懸濁の程度について 削除/引用 No.7094-1 - 2018/07/21 (土) 21:14:55 - anonymous 初めてこちらで質問させていただきます。 当方、生物系研究室の修士課程で細胞培養を用いた実験をルーチンとして行っています。 そこで細胞のストックをとる際の操作について質問なのですが、トリプシン処理でdishから剥がして遠心して落とした細胞ペレットを細胞ストック溶液で再懸濁するとき、どの程度の回数ピペッティングしていますか？ 細胞ストック溶液は細胞に毒性があり、強くピペッティングしてしまうと細胞の生存率に影響力があるという話は聞いているので、弱めにピペッティングしています。しかし、そうするとペレットが崩れるまで長い時間がかかってしまいます。あまり長い時間r.t.で細胞ストック溶液中に細胞がある状態にもしたくないので丁度いい具合というのが知りたいです。 また、以前どうしてもペレットが懸濁しきらないままストックをとった細胞があるのですが、そのストックから起こした細胞は見た目上は正常に生きています。しかし、ペレットのまま保存されたことによって細胞に何か変化が起きないか心配です。 基本的なことで申し訳ありませんがよろしくお願いします。

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