テクニカルな質問というわけではないのですが、論文を読んで色々なアイデアを考えたりしているところです。論文を読んで、私はスクリーニングに興味があります。新しい何かを拾いあげるところに面白さを感じています。ただ私はこれまでにそういった実験はしてきませんでした。
Dr. Feng Zhangラボが作製した、Human CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) が様々な論文で使われています。Addgeneで＄500で購入できそうです。
これを用いたスクリーニングの原理はわかりました。レンチ感染によりgRNAを恒常的に発現させ、何かの篩の後、その篩で選択された細胞をディープシークエンスし、gRNAの標的を同定するというものだと思います。
ただ、この＄500の品とは一体どんなものなのでしょうか？
addgene.org/pooled-library/zhang-human-gecko-v2/
これを読むと、プラスミドが送られてくるようです。
このプラスミドを受け取ったら、それを大腸菌に形質転換し、までは予想できるのですが、その後はどうするのでしょうか？
1：形質転換したらそれをLBプレート（抗生剤有り）にまき、翌日出現したコロニーをスクレイパーで掻き取り、バルクな大腸菌からプラスミド抽出
2：形質転換したらそれを液体培養のまま増幅？翌日そこからプラスミド抽出
などでしょうか？？
私自身ライブラリーについてその実態や取り扱い方を理解していません。
調べると、液体培養では特定のものが増えやすいなどあり、バイアスがかかるおそれがあることからプレートに撒くと書かれてありました。その場合、スクレイパーで掻き取ればいいのでしょうか？？
何かバイアスがかからないような注意事項はありますか？ご存知でしたら教えてください。 |
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