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サブクローニングする際の制限酵素の選択 トピック削除
No.713-TOPIC - 2012/07/04 (水) 21:53:18 - 初心者
ベクターに2種類の制限酵素を用いてインサートを組み換えています。インサートに存在しない配列の制限酵素が、ベクターのマルチクローニングサイトにいくつかあるのですが、この場合どのような基準で制限酵素を選択したらよいでしょうか?
 
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No.713-11 - 2012/07/31 (火) 09:33:19 - 初心者
ご解答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.713-10 - 2012/07/06 (金) 08:59:26 - 774
NEBのカタログの巻末に、認識配列から端まで何bp必要なのかをまとめたページが参考になるかと思います。
たいてい3bpあれば大丈夫なようですが。

(無題) 削除/引用
No.713-9 - 2012/07/06 (金) 06:13:51 - 初心者
ご返事ありがとうございます。とても参考になりました。以下のご回答について重ねてお聞きしたいことがあるのですが、ベクターのマルチクローニングサイトの2種類の制限酵素配列が近すぎると、片方の制限酵素でしか切れなくなるという解釈で正しいでしょうか?そのようなことは、実際よくあることなのでしょうか?

>[Re:8] モモさんは書きました :
> 切断した後の断端が近すぎて片方でしか切れなくなるような組み合わせも避けます。

(無題) 削除/引用
No.713-8 - 2012/07/05 (木) 19:01:12 - モモ
切断した後が2つともブラントエンドになるのは避けます。
切断した後が2つとも同じになる酵素の組み合わせも私は避けます(SalとXhoなど。中には好きな人もいます)。
切断した後の断端が近すぎて片方でしか切れなくなるような組み合わせも避けます。
メチレーションが影響を受ける配列のときはその酵素も避けます。

(無題) 削除/引用
No.713-7 - 2012/07/05 (木) 18:56:25 - AP
>2についてなのですが、安定な制限酵素を調べる方法はございますでしょうか?

「安定な」という表現が私の意図にあっていたかどうか、ニュアンスが伝わったかどうかが自信ないのですが、

といあえず、酵素の安定性の目安としては、メーカーの資料に、反応条件で長時間インキュベートした場合の残存活性があると思うので、それが参考になります。ものによって、一晩インキュベートしても活性を保持するものもあれば、2時間程度のインキュベートでほとんど活性のなくなってしまうものもあります。
大量のDNAを消化するとき、酵素を節約したい時など、反応時間を伸ばすことで酵素量の不足を補うという手段がありますが、安定性の低い酵素には向きません。

それとは別に、cccに対して効きにくい制限酵素があります。ふつう、1 ug DNAに対して1 unitあれば1時間で完全消化できると見積もりますが、cccに対してはその数倍から数十倍の酵素量が必要なものもあります。これも、メーカーの資料をみればわかります。なるべくなら、そういう酵素を使わないように済むようにというのもデザインのポイントになります。

> 2.なるべくありふれた(安価、安定)の酵素を選ぶ。
あまりメジャーでない酵素は、高価だし、安定性(shelf life)や切れ味に癖のあるものが多いです。研究室であまりターンオーバーしない(使用期限までに使いきらなくてもったいない)、常備されていない(使おうとおもったらなかった)てことも起こりがちです。

(無題) 削除/引用
No.713-6 - 2012/07/05 (木) 03:11:20 - 初心者
ご返事ありがとうございます。
入れた先のインサートの向きをそろえても、選択できる制限酵素の種類がいくつかあります。

>[Re:3] Harmoniaさんは書きました :
> >ベクターに2種類の制限酵素を用いて
> ということは、入れた先のインサートの向きも大切ですか?
> それなら、選択の余地がぐっと狭まり、選ぶという悩みは少なくなります。

(無題) 削除/引用
No.713-5 - 2012/07/05 (木) 03:09:05 - 初心者
ご返事ありがとうございます。
1と3は参考にさせていただきます。
2についてなのですが、安定な制限酵素を調べる方法はございますでしょうか?

>[Re:2] APさんは書きました :
> 優先順位で
> 1.同じバッファーで問題のない(至適である)二種類の酵素を選ぶ。
> 2.なるべくありふれた(安価、安定)の酵素を選ぶ。
> 3.再切り出しするときに、なるべく多くの酵素が使えるような(クローニングに使ったサイトの外側にも使えるサイトが残るように)サイトを選ぶ。

(無題) 削除/引用
No.713-3 - 2012/07/04 (水) 22:09:44 - Harmonia
>ベクターに2種類の制限酵素を用いて
ということは、入れた先のインサートの向きも大切ですか?
それなら、選択の余地がぐっと狭まり、選ぶという悩みは少なくなります。

(無題) 削除/引用
No.713-2 - 2012/07/04 (水) 22:05:38 - AP
優先順位で
1.同じバッファーで問題のない(至適である)二種類の酵素を選ぶ。
2.なるべくありふれた(安価、安定)の酵素を選ぶ。
3.再切り出しするときに、なるべく多くの酵素が使えるような(クローニングに使ったサイトの外側にも使えるサイトが残るように)サイトを選ぶ。

サブクローニングする際の制限酵素の選択 削除/引用
No.713-1 - 2012/07/04 (水) 21:53:18 - 初心者
ベクターに2種類の制限酵素を用いてインサートを組み換えています。インサートに存在しない配列の制限酵素が、ベクターのマルチクローニングサイトにいくつかあるのですが、この場合どのような基準で制限酵素を選択したらよいでしょうか?

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