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経過報告 削除/引用 No.7141-14 - 2018/08/26 (日) 23:40:44 - shiganai お返事、ご協力頂いたみなさま 遅くなりましたがその後の経過の報告です。 バンド、出ました。皆様のおかげです。本当にありがとうございました。 塩化コバルトでも低酸素でもバンドを確認できました。 結局、TCAは使用せず、RIPA bufferのみで行けました。 変更したのは以下の点です。 ・回収時の洗浄を1回に削減。 ・RIPAかけて5分シェイクはあってもなくてもバンドでました。 ・スクレーパーで回収後のインキュベーションを45分に延長。 ・超音波破砕器あったので使用しましたが、使用の有無にかかわらずバンドでました。 ・抗体をNOVUSのNB100-473に変更。 先日、NOVUSでバンドが出た同じサンプルを他の抗体でやったら出なかったので、抗体の影響はかなりあったのだと思います。 また、バンドが出て疑問が出たのですが ダイマーもしくはアイソタイプなのだろうと思いますが、100kDa付近と120kDa付近に2本のバンドが出ました。 みなさんもそのような経験あるのでしょうか。またそれについて何かご存知でしたら教えていただけますと幸いです。並行して論文あさり中です。

(無題) 削除/引用 No.7141-13 - 2018/08/20 (月) 09:58:22 - PD 細胞にもよるのかもしれませんが、平滑筋細胞は６時間でピークになっていました。 >[Re:12] wせdfrgthyじゅいkl、さんは書きました : > 何点かタイムコースしてみてますか。低酸素暴露初期と8時間後でprotein levelの発現が同じままなのかどうかわからない。たぶんどこかにピークがあるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.7141-12 - 2018/08/18 (土) 11:24:38 - wせdfrgthyじゅいkl、 何点かタイムコースしてみてますか。低酸素暴露初期と8時間後でprotein levelの発現が同じままなのかどうかわからない。たぶんどこかにピークがあるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.7141-11 - 2018/08/18 (土) 06:48:02 - もち >[Re:10] shiganaiさんは書きました : > �Dそれでもだめなら10% TCAでやってみます。 > 　ちなみに10% TCAでバッと固定した後は、どのような手順になるのでしょうか。。。 > 　https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo03_03.html > 　↑このやり方に従ってみようかと思います。 当方もそのサイトを参考にしました。確か尿素入りの溶解バッファーを使いました。リパだと出なかったような・・・（なぜかはわかりません。手技の問題だったのか・・・？） よろしかったら結果を是非伺いたいと思いますのでご報告お待ちしております。

みなさんありがとうございます。 削除/引用 No.7141-10 - 2018/08/17 (金) 08:29:26 - shiganai おはようございます。 予想以上にみなさんからアドバイス頂き、ありがとうございます。 みなさんからの意見をまとめまして、大きな変更がない順に試してみたいと思います。 �@CoCl2投与でポジコンを作る。 　CoCl2・6水和物は購入済なので、 　HeLaで1x10^5/wellで6ウェルに播いて、ある程度コンフルなったところで 　CoCl2 100µMで24時間インキュベートでしてみます。 �Aタンパク抽出の際に条件を変える。 　早くするために、PBS washを1回にして 　抽出効率上げるために遠心前のインキュベーションを30分〜40分にしてみます。 �B抗体を変えてみる。 　もともとラボにあったSanta cruzのものでしていたので、新しく＞PDさんのコメントを参考に 　NOVUSのものを頼んでみようとおもいます。 �C上でもだめなら、MG132をOnしてみます。 �Dそれでもだめなら10% TCAでやってみます。 　ちなみに10% TCAでバッと固定した後は、どのような手順になるのでしょうか。。。 　https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo03_03.html 　↑このやり方に従ってみようかと思います。 本当に貴重なご意見、アドバイスありがとうございました。 無事、バンドがでるあるいは何をやってもだめなときはまた報告・相談させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.7141-9 - 2018/08/17 (金) 02:08:59 - おお >ってか流石にそんなにすぐに分解されるものだろうか？というのは疑問ですが。 そうですねぇ。PBSで洗っていたりすると間に合わないとかいう意見もよくあったのですが、感覚的には違和感があります。実際やったことがないので経験者の意見を覆せるほどの材料は持ってませんでしたし。 No.7141-6 - PDさんのやり方をみると慌ててすぐ変性状態でLysisするほどでもなく、Lysis bufferの抽出効率が問題なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7141-8 - 2018/08/17 (金) 01:30:54 - wsdzfxcvb とりあえずコバルト入れて培養して、強引に安定化して検出できるかどうか見てみたらどうか。

(無題) 削除/引用 No.7141-7 - 2018/08/16 (木) 18:17:37 - asan 直接処理する場合は血清アルブミン等の持ち込みが気になりますね。固定する場合はホルマリン等なら熱変性させて脱クロスリンクすれば一応ウエスタンできますが、脱クロが甘いとバンドが汚くなります。 Wholeでやってるなら核抽出すればまだマシかもしれませんが、RIPAでlysisしてるなら核も取れてると思うので、あまり効果はないかもですね。とりあえず抗体が悪い可能性もあるので、Feとかコバルト処理でポジコンはあった方がいいともいます。 ってか流石にそんなにすぐに分解されるものだろうか？というのは疑問ですが。 RIPAをくわえてからシェイクしてかきとりだけど、この辺の処理が甘いので十分lysisされてない状態なんじゃないかと思ったり。かきとってよくlysisしてからon tubeでインキュベートすれば十分じゃないかとも思います。シリンジ通すのはDNAの細断でしょう。

(無題) 削除/引用 No.7141-6 - 2018/08/16 (木) 13:22:02 - PD 私もHIF1のWBやったことありますが、普通にバンドでてました。 �@Dish取出し �A冷PBS washx1 �BLysis buffer �Cすぐにスクレーパーで回収 �Don ice （または凍結保存） �E超音波破砕 �F4℃遠心 Lysis bufferはRIPAではなく1%SDS, 4M Urea, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 50mM Tris, protease inhibitor, pH8という組成のものを使用しています。抗体はNOVUSのnb100-479を1/1500で４℃ o/nです。

(無題) 削除/引用 No.7141-5 - 2018/08/16 (木) 07:54:25 - おお ＞培地を捨ててPBSで洗わず とかきましたが、たぶんその場合培地の血清の持ち込みは多くなります。どのくらい影響があるかは実験次第、環境次第かもしれません。ふと思ったのはPBSも低酸素チャンバーで予めIncubateしてたらPBSのWashで低酸素が維持されるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7141-4 - 2018/08/16 (木) 07:25:44 - もち 当方もウエスタンでヒフが出なくて困ったことがあります。プラスミドが採れないさん、できればコツを教えていただきたいです。私は必ずポジコンサンプルを入れました。低酸素ではなく普通のインキュベーションで塩化コバルトで処置したサンプルです。これは比較的簡単にヒフの位置にバンドが出るのでわかりやすいと思います。低酸素刺激したものはおおさんのおっしゃるようにTCA10％で固定しないと出ませんでした。最初はりぱでとにかく手早くサンプルを作ったのですがダメで、TCA固定にしてやっと出てくれました。それでもとにかくすばやく固定しました。チャンバーからディッシュを取り出した瞬間にザバッと固定液をかけました。回収後はソニケーションをかけました。あと抗体にもよりました。CSTのヒフ抗体ではでませんでしたが、ミリポアのものででましたのでそちらを利用しました。今パッと思い出したものでこのような感じです。shiganaiさんがもし上手くいきましたらぜひ教えていただきたいです。いくつか論文を検索しますときれいにバンドが出ているものがありますが、どうやっているのか気になっていましたので。

(無題) 削除/引用 No.7141-3 - 2018/08/16 (木) 03:10:53 - おお 培地を捨ててPBSで洗わずサンプルバッファーやHot lysisバッファーで回収するか、TCA１０％でプロテアーゼ活性をとめてから回収するとどうかなと。

(無題) 削除/引用 No.7141-2 - 2018/08/16 (木) 00:03:10 - プラスミドが採れない MG132を加えたらいかがでしょう？ ヒフ抗体がワークしていると示すポジコンはありますか？ うちではルーチンにヒフ見てますよん。 胎児とかいいと思いますけど。

低酸素条件下でのHIF-1α発現をウエスタンブロットでみたい。 削除/引用 No.7141-1 - 2018/08/15 (水) 22:35:18 - shiganai はじめまして。 今年度から大学院で研究を始めた者です。 HIF-1α発現に関わる分子に関する研究テーマに取り組んでいます。 低酸素チャンバーで低酸素刺激（O2 1%, CO2 5%, N2 94%）に暴露させ HIF-1αの発現をウエスタンで評価しようとしていますが、なかなかコントロールでもHIF-1αの発現がうまくバンドで出ません。 HIF-1αは低酸素が解除されてからの分解が早く、チャンバーから出してなるべく急いでいますが、それでもうまくいきません。 タンパク抽出をRIPAのプロトコルに従って下記の手順でしていますが、アドバイス頂けますとありがたいです。 6ウェルプレートで行っています。 ・低酸素（4時間〜8時間）刺激 ・チャンバーから出してOn iceで培地除去。 ・冷PBSで2回洗浄 ・RIPA buffer 1X（10Xを調整。PI含、SDS含）を添加 ・5分シェイク ・セルスクレーパーで剥がして回収 ・21Gで細断 ・20分インキュベーション ・4℃、10000G、10分遠心して上清を回収。 HIF-1αを扱っている方は、どんな工夫をされているのでしょうか。 差し支えなければ教えて頂きたいです。

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