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(無題) 削除/引用 No.7149-5 - 2018/08/17 (金) 01:28:34 - wsdzfxcvb mini gelですか？大きいサイズのゲルですか？

(無題) 削除/引用 No.7149-4 - 2018/08/17 (金) 00:46:51 - おお ＞ただ、40 ugは自分の感覚的にはすでにかなりオーバーロード気味 わたしもミニゲルでやるならコームのサイズが狭いと（ばいおらっどで１５Wellとか）同じような感覚があります。

(無題) 削除/引用 No.7149-3 - 2018/08/16 (木) 18:45:03 - おお もしロードするタンパク量を上げるならゲルのサイズも大きくしたほうがいいような気がします。 のせる量が２倍ぐらい変わって劇的に感度が変わるだろうかと思うような気がしますし、発現量が若干下がったら見えなくなってしまうような系ではあまり信用できる系ともいえません。５倍、１０倍のレンジで変えられるならやる価値があると思いますけど（たとえば収量がすくなく１マイクログラムくらいのせてたけど、プレぱレーションのスケールを何とかあげて５マイクログラム取れるようにしたとか）。 80ugとかなると、ちょっとタンパク量も多くなってくるのでOver load気味になって分解能が悪くなりかえって検出が難しくなるかもしれません。そういう意味では場合によっては下げたほうが検出できるようになることもあると思います。 いまはヶミルミも高感度のものが売られているのでそういうのを試す手もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.7149-2 - 2018/08/16 (木) 18:40:23 - asan 1 ugを 10 ugに変えるなら可能性はあると思いますが、10ugを20ugに変えて全く見えなかったものが見えるようになるとは考えにくいと思います。ただ、40 ugは自分の感覚的にはすでにかなりオーバーロード気味なので、それ以上あげようとは思いませんかね。 ブロッキングや抗体のO/Nや室温、2次抗体との組み合わせなんかは結構相性があったりもするので、それで何も見えない状態から見えるようになるというものでもないような気がします。ただ、BSAはブロッキング力が弱いので抗体によってはバックが出やすいのでミルクの方が個人的には好きだったりしますが、見えないなら試して見る価値はあると思います。1次抗体2次抗体の濃度をあげてみてうんともすんともいかないならポジコンがないとそもそも抗体がだめなのか、細胞で検出限界以下か（抽出できてないのか）はわかりませんね。

ウエスタンでロードするタンパク濃度 削除/引用 No.7149-1 - 2018/08/16 (木) 18:31:03 - ウエスタン 検出するタンパクによって異なるかとは思いますが、ロードするサンプル量を40ugではバンドが一切見えないのに80ugにするとバンドが見えるようになることはありますでしょうか？ 自分の経験的には40で一切見えなければ80にあげて（またはそれ以上に）やりますが、あまり改善されたことはありません。 それよりブロッキングをBSAにしたりする方がクリティカルな印象ですが。

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