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(無題) 削除/引用 No.7150-10 - 2018/08/17 (金) 23:43:28 - あ 追記：もちろん、総cDNA量の変動が考えられる刺激（凍結再融解、長期間にわたるon iceでの静置など）のあとは内部標準を取り直したほうが無難だと思います。ですが、2、3プレートでのリアルタイムPCR（6時間以内には終わる？）を一気にやるのであれば要りませんね。プラクティカルに自分にとってどちらが都合がいいのか考える必要があります。

(無題) 削除/引用 No.7150-9 - 2018/08/17 (金) 23:35:38 - あ 基本的にはおかなくて大丈夫なはずです。 内部標準はサンプルの総cDNA量のばらつきを補正をするものであり、各サンプルの総cDNA量の比が一度分かればもうとる必要はないと思います。プレート間の差の補正は検量線を再現よく正確に引くほうがよほど重要です。いくらプレート間の差があってもプレート内でのPCR効率やシグナル検知能力が揃っていれば検量線を元にプレートに寄らない普遍的な量を測ることが可能ですし、検量線が正しく引けていることがプレート内でそれらの条件が揃っていることの部分的な担保になります。

(無題) 削除/引用 No.7150-8 - 2018/08/17 (金) 20:15:41 - asan WBとか他の方法と同じような解釈をすればいいと思います。 サンプル間で比較する必要がある同じ遺伝子の増幅は基本同じプレート、同一測定でやるべきだとおもいますが、スタンダードとしての測定と実際に見たいものを別プレートで測っても、同じサンプル由来で、同一条件での比較なので、仮に測定誤差があっても内部標準全てに同じ程度に差が出るという考えだと思います。 極論言えば、ウエスタンの発現量を全体のcDNA量で割ったって比較になるし、実際にRNA seqとかproteomicsだと、内部標準に対するレシオより全測定遺伝子のexpressionのmedian等を一致させるような補正をかけることは普通に行われてます。 あとは、どこまで厳密に相対定量を議論するか、テクニカルエラーを考えるかでしょうが、例えばそもそもddCT法で測定してるならいつ測定しようが増幅効率は約2倍と設定してるので、大きな差が生じない程度の実験誤差が前提になるかと思いますしね。 ってか、測定したいRTサンプル数が多くなると1枚で測るのは実際無理でしょう。

(無題) 削除/引用 No.7150-7 - 2018/08/17 (金) 17:01:21 - SYBR master 我々の所では > 1枚目のプレート：内部標準コントロール > 2枚目のプレート：ターゲット遺伝子A > 3枚目のプレート：ターゲット遺伝子B でやっていましたが、ただし条件を付けて行っていました。 1. プレートの作成は同じ時に行う(3枚なら3枚同時に作成)。 2. そのとき反応液はprimer以外をmixして大本を作成し、これを分注後にprimerを加える 2. 遺伝子数が多くなると1日では終わらないときは、再度内部標準のプレートを作成する。 1と2の条件で作成すれば、サンプルの一部を除いて1枚に載せたときと、結果がほぼ同じであったことは一応確認してあります。 3の条件は、cDNAを凍結融解したときに分解が怖かったこためです。しかし、連日で行ったときは、少なくとも内部標準のデータではほとんど差が出てい無いことは確認してあります。 不安なら、同じように試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7150-6 - 2018/08/17 (金) 14:55:25 - AP >1枚のプレートに内部標準とターゲット遺伝子を同時の載せて測定するべきなのでしょうか。 教科書的には、そしてメーカーのインストラクションではそうなってるんじゃないですか？　少なくともABのはそう。

(無題) 削除/引用 No.7150-5 - 2018/08/17 (金) 14:46:27 - おお ラボの環境でもデーターの出方に幅があると思いますけどたとえば同じサンプルをいろいろな実験のために複数回同じ遺伝子をみていて、プレートが違うことでどれくらいぶれがあるかなど分かりませんか？ 個人的には仮に違うプレートでInternal　Controlをやってプレート全体でぶれたとしても相対的に変わらないと思うので測定は可能だと思ってます。 理想論として一緒のプレートがいいというのはそういう人もいるのでそこは否定しませんけど。ただあんまりｑPCRをする人間ではないので、他の意見もつけばいいですね。

(無題) 削除/引用 No.7150-4 - 2018/08/17 (金) 14:30:34 - おお 一般論として聞いたわけですが、、、

(無題) 削除/引用 No.7150-3 - 2018/08/17 (金) 14:12:35 - リアルタイム祭り実施中 >[Re:2] おおさんは書きました : > もし内部標準が他のみたい遺伝子のプライマーセットのTmと違ったら同じプレートにおけるの？ リアルタイム用のプライマーセットはTm値が同じくらいになるように 設計していて、ワークすることも確認しています。 なので、PCRのプログラムを同一にすることに関しては問題ないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.7150-2 - 2018/08/17 (金) 13:38:57 - おお もし内部標準が他のみたい遺伝子のプライマーセットのTmと違ったら同じプレートにおけるの？

リアルタイムPCRではプレートごとに内部標準をおくべきか 削除/引用 No.7150-1 - 2018/08/17 (金) 10:30:26 - リアルタイム祭り実施中 リアルタイムPCRでは、96wellプレートを用いて、検量線を引いて相対定量を行っています。 ここで問題が出てきました。 cDNAサンプルが20個あり、検量線の希釈系列が4個、NTCが1個。 そして、すべてduplicateにするので、ひとつの遺伝子につき50well使用することになり、 1プレートにつき1遺伝子しか載せることができません。 このような場合、 1枚目のプレート：内部標準コントロール 2枚目のプレート：ターゲット遺伝子A 3枚目のプレート：ターゲット遺伝子B ・・・・・ としても良いものなのでしょうか。 それとも、20個のcDNAサンプルを適当にいくつかのグループに分け、 必ず、1枚のプレートに内部標準とターゲット遺伝子を同時の載せて測定するべきなのでしょうか。 ラボ内でも意見が分かれているので、皆様のやり方や、一般的な見解がありましたら教えていただきたいです。 よろしくお願いします。

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