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(無題) 削除/引用 No.7154-6 - 2018/08/23 (木) 10:53:58 - ２ IEF gelからSDS-PAGEのgelへの移行が上手くいけてないとそういうことあります。IEF　gelはSDS-PAGEのgelにアガロースとかで固定することが行われますが、あれの良否が結構、結果に大きく影響するという話も聞きます。で、のせて上からコームで抑えるだけの方がむしろいいという人もいます。間に気泡とかあるとうまくいきません。でもpI markerではいけてたならあまりかんけいなきかもしれないですが。 平衡化でそれなりに蛋白質のロスは起こりますが、30~40minくらいならそんなに影響するほどではないです。 等電点沈殿といって、多くの蛋白質は等電点付近で一番溶けにくくなります。で、ものによってはIEF中に長く等電点近傍のpHにさらされているとゲル内で凝集不溶化してしまうこともあるようです。CHAPSやUreaなどの効果は期待出来ますが、万能ではないし、SDS平衡化でそれなりに可溶化できるものもあるかもしれないですが、それも限度があるので、不溶化するときはします。溶けなければ、２−D目のゲルに移行することは出来ませんので、質問のような結果になることはあります。2-DPAGE終了後に１D目のIEF gelを染色してみてください。上手く移行していれば、ほとんど何も染まらないはずでので、もし蛋白質がかなり残っていたらたぶんそうしたことが原因かもしれません。実際にはあまりメジャーなトラブルではないですが、生物種によってはそういうことが起こりやすい蛋白質が多いのかもしれないです。 あと、ポリアクリルアミドを支持体とするIEFでは100KDaをこえるような高分子量蛋白質は2-D目に移行しにくかったり、IEFで分離がしにくかったりします。これらは1D目IEFでアガロースIEFを使うと改善されます。

(無題) 削除/引用 No.7154-5 - 2018/08/21 (火) 11:41:34 - ゆう おおさん ありがとうございます。 >これって結構なタンパク量だけどどれくらい乗ってるのですか？ タンパク質量は 50μg〜300μg の範囲で試しました。 >１D終了時の電流が気になるところですが、、、 泳動開始時が約6mA 100 V 1h：2mA 200 V 1h：1mA 500 V 30min：4mA でした。タンパク質量を変えてもこれは変わりませんでした。 塩濃度に関しては、限外ろ過による脱塩も試しましたが結果に違いはありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.7154-4 - 2018/08/21 (火) 10:21:36 - ゆう qqさん ありがとうございます。 >TEFCOのゲルは、可溶性蛋白用だと書いてありましたが、IEFの泳動バッファーは、ウレアや界面活性剤を含んでいるのでしょうか？ IEFの泳動バッファーにはUreaや界面活性剤は含まれていません。 タンパク質抽出バッファーには含まれています。 >あなたの使用されている平衡化バッファー組成に少し疑問があります。 すみません。平衡化バッファーの組成を書き間違えておりました。 6M Urea, 33mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 0.5% DTT が正しい組成でした。 また、20% Glycerolを入れた場合や、TrisのpHを8.8に変えた場合も試しましたが、いずれもうまくいきませんでした。 TrisのpH に関しては、ヨードアセトアミドを使う際は 8.8 にする必要があると理解しています。 >2次元目の泳動バッファーは、Tris-Gly-SDSを使ってますかね？ はい。Tris-Gly-SDS系を使用しています。 個人的にずっと疑問だったのですが、二次元電気泳動では二次元目のゲルや平衡化バッファーにGlycerolが含まれていることが多いようですが、この狙いは何でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7154-3 - 2018/08/21 (火) 03:45:30 - おお >タンパク質抽出は、巻貝の全脳(米粒大) × 10を液体窒素で凍結し、プラスチックペッスルにて破砕した後、Lysis buffer に溶解しています。 これって結構なタンパク量だけどどれくらい乗ってるのですか？ >一次元目：100V 1h, 200V 1h, 500V 30min 大量の蛋白や、それに伴ったりする塩濃度によりきれいにpIに蛋白が流れなかったり余計に時間がかかったりします。そういう意味では１D終了時の電流が気になるところですが、、、スラブゲルでやっているので判断が難しいかな、、、 ところでDTTとかは全く使わないのですか？１D目は還元剤があるpH領域で泳動を乱す事があったと思うのでDTTがベストかわからないですけど（場合によっては入れないのは選択肢なのかもしれませんが）、２Dめは入れてもいいようなきがします。 オーバーロードがちょっと気になっているところですが、希釈系列を作ってみるとどうかなと思ったりもします。

(無題) 削除/引用 No.7154-2 - 2018/08/20 (月) 21:29:37 - qq TEFCOのゲルは、可溶性蛋白用だと書いてありましたが、IEFの泳動バッファーは、ウレアや界面活性剤を含んでいるのでしょうか？ あなたの使用されている平衡化バッファー組成に少し疑問があります。 平衡化バッファー組成：6M Urea, 1M Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS 私は、BioRadのReady-Stripを使っての条件ですが、 平衡化バッファー組成：20% Glycerol, 0.375M Tris-HCl(pH 8.8), 2% SDS を使い、ゲルストリップを2次元目にアプライする前に、蒸留水にくぐらせてから載せています。 Ureaを入れるなと言うことではなく、Trisの濃度とpHは適切なのだろうかということです。 2次元目の泳動バッファーは、Tris-Gly-SDSを使ってますかね？

二次元電気泳動でスポットがでません 削除/引用 No.7154-1 - 2018/08/20 (月) 16:09:50 - ゆう 二次元電気泳動でスポットが全く見えません。 一次元目ではCBB染色でバンドがはっきりと見えています。 ところが二次元目まで流して染色すると、一切何も染まりません。 泳動の下端に一次元目ゲル中に含まれていたアンフォライトと思しき像が見える程度です。 また、pIマーカーを二次元電気泳動した際には、きちんと所定のpI・分子量の位置にスポットが見えました。 しかし、抽出サンプルではスポットが見えません。 タンパク質抽出は、巻貝の全脳(米粒大) × 10を液体窒素で凍結し、プラスチックペッスルにて破砕した後、Lysis buffer に溶解しています。 Lysis buffer組成： 7M Urea, 2M Thiourea, 3% CHAPS, 1% Triton X-100 等電点電気泳動にはIEF-PAGE mini(pH3〜10) (TEFCO, 04-665A-4)を使用しています。泳動バッファー等もTEFCOの専用のものを使用していります。 SDS平衡化は室温で20分平衡化しています。40分で試したことや、ヨードアセトアミドを入れて二回平衡化も試しました。 平衡化バッファー組成： 6M Urea, 1M Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS 泳動条件は、 一次元目：100V 1h, 200V 1h, 500V 30min 二次元目：120V 1〜1.5h 二次元目ゲルは12.5%で10cm × 10cmのサイズです。 どこの操作が悪いのか良く分からず困っています。 もしやTEFCOのキットが良くないのではないかと思い、今後はゲルをガラス管で手作りして試そうと考えています（よく見るとキットのHPの写真はあまりきれいな泳動像ではない）。 しかしその前に、現在のやり方に問題がないか、二次元電気泳動で気をつけるべき基本的なことが抜けていないか確かめたく投稿いたしました。 助言をいただけますと幸いです。

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