全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.7177-4 - 2018/08/27 (月) 09:56:09 - AP 先に投稿したつもりのレスが投稿されていなかったみたいなので、書き直します。 PCR産物を精製なしに制限酵素消化してよいかどうかは、目的や実験デザインによります。 ligationに持っていくなら精製すべきです。なぜならポリメラーゼ活性が残っていると、制限酵素消化で生じた付着末端が平滑化されるからです。 3'陥没末端だとポリメラーゼ活性で埋め戻されてしまします。3'突出末端だと校正活性のある酵素だと削られてしまいます。 理屈から言えば、平滑末端消化や、3'突出末端消化で校正活性のないポリメラーゼを使う場合はセーフということになりますが、事故の元だと思います。例えば校正活性のある酵素もdNTPが枯渇すると平滑末端を通り過ぎて3'末端を削り込みます。 ライゲーションではなく、PCR産物の消化パターンを見るだけだったら、PCR反応産物を精製せずに直接、制限酵素消化というのもありです。

(無題) 削除/引用 No.7177-3 - 2018/08/27 (月) 09:45:18 - AP PCRバッファー中での各種制限酵素の活性に関する資料はNEB等が出しています。 フェルメンタスは大抵の酵素はPCRバッファー中で切れるけれど、そうでないのもあるとしてPCR反応液を３倍希釈する系を推奨しています。 まあ、精製・バッファ交換するのが王道でしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.7177-2 - 2018/08/27 (月) 08:42:00 - おお たいていの場合は切れるとおもいますが制限酵素によってはきれいに精製されてないと切れにくいものもあるにはあります。PCRがかかりやすくするためPCR反応溶液に添加物がある場合があります。DMSO、ベタイン、グリセロール、場合によってはホルムアミドです。ベタインはかなりの高濃度くわえるので、制限酵素反応溶液への持込がかなり高くなるとおもいます。グリセロールは多いとスター活性の原因となりえます。 よく分からないならとりあえずはエタチンぐらいはやったほうがいいかと思います。クロロフォルムエタチンならなおよいでしょう。 もしPfuとか校正活性があるものを使っているなら、制限酵素反応中PCR産物末端が削られる可能性がありますので、ゲル切り出しか、スピンカラムで精製などをお勧めします。

PCR終わった後そのまま制限酵素処理してもいいんですか？ 削除/引用 No.7177-1 - 2018/08/27 (月) 00:36:05 - PCR PCR終わった後そのまま制限酵素処理してもいいんですか？ それともゲル切り出しか、スピンカラムで精製しないといかんのでしょうか？ もちろん酵素処理後にはライゲーション前にそれはしないといかんのでしょうが。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---