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(無題) 削除/引用 No.7194-7 - 2018/09/04 (火) 06:14:17 - koh おお様、tghyじゅ４５６７様 再度、ご回答ありがとうございます。 おお様 おお様の仰る方法とは見たいレーンを同じ範囲で指定し、MeanかIntDenでみる方法ですか。 tghyじゅ４５６７様 すみません、今回はCBBでの染色だったので2倍で濃度をふってもいいかと思って希釈してしまいました。 Plot Laneでの面積比較は「ピークの面積x強度(輝度？)」、ROIで指定してIntDenで測定した場合は「指定した範囲内の輝度の総和」みたいに考えればいいのでしょうか。 画素解析素人なのでお恥ずかしいです。

(無題) 削除/引用 No.7194-6 - 2018/09/04 (火) 02:39:50 - tghyじゅ４５６７ ECLは飽和しやすくて直線性のある範囲が狭い（すぐ飽和して頭打ち状態になる）のが欠点なので、この範囲に収まるようにアプライする蛋白質量を設定しないと、「アプライ量４倍違うのに、シグナル強度１．５倍しか違わない、なんで？」とかになるので、具体的にーーー倍増えたとかみたいに定量するならば、直線性を示す範囲に入るようにアプライ量を設定するのがとても大事。

(無題) 削除/引用 No.7194-5 - 2018/09/04 (火) 01:29:28 - おお ＞ROI Managerで見たいバンドを登録しておいて こちらの方ですが、私が思っている方法と同じならバックグランドを取るのにバンドがないところを加えておくといいかと思います。レーンごとにバックグランドが違いそうなときは、各レーン上目的のバンドに近いバンドがない部分（バンドの上部とか下部とか）をとっておいてそのバックグランドをそのレーンのバンドのIntensityから差し引くといいかと。

(無題) 削除/引用 No.7194-4 - 2018/09/03 (月) 18:18:49 - koh tghyじゅ４５６７様、おお様 お忙しいところ、ご回答ありがとうございます。 確かにtghyじゅ４５６７様の仰るようにタイトレーションしていないので、正確には何とも言えないですね。すみません。 ただ、濃度がわかっているサンプルを2倍、4倍と希釈して泳動、染色、解析してもROI Managerを使ってmeanやIntDenを比較すると1.4倍の濃度差しか出ないときがあるので不思議に思っていました。 おお様の仰るようにバンドの歪み具合いによって、どちらかの方法がいいかはありますね。選択する範囲によってバックの拾い方も変わりますし… ただ、印象として先生方の仰るPlot Laneでピークを測定、直線でピークを囲って、魔法の杖ツールで面積を測定した結果の方が前述の濃度がわかっているサンプルを2倍、4倍と希釈した際に、それなりの結果になるように思いました。

(無題) 削除/引用 No.7194-3 - 2018/09/03 (月) 14:12:44 - おお どっちがいいかは状況で変わってくると思いますし、得られたバンドの濃さの範囲でスタンダードをとらないとどちらが実際の量に近いかはわからないでしょう。 得られる値はバックグランドのとり方に左右されるので測り方によってバックグランドが変わるからだと思います。個人的にはPlot Laneでピークを測定、直線でピークを囲う方法でやっていました（いまはImageJではないので）が、ゲルやバンドの歪具合によっては後者を使うこともありました。 せっかくだから両者でバックグランドがどのようにすれば同様の値が取れるのかとかいろいろ試行錯誤しておいて使い慣れるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7194-2 - 2018/09/03 (月) 12:17:01 - tghyじゅ４５６７ 前者でやってます。いくつか方法はあるようですが、本とかWebでもこの方法が多かったので。WBでの定量は、現実的にはあくまでも見た目を数値化することにより、データにある程度の客観性を付与し本文で記述する際の説得力を多少増すことが目的ですので、眼で見たときと比べて、あまりかけ離れていたらそれは適切でないのだとおもいます。 単に有意多い少ないとかでなくて具体的に何倍とか定量をしたいならば、むしろ、適正な蛋白質量が泳動されているかどうかの方が遥かに重要で、あらかじめタイトレーションして、直線性のある範囲を把握してから実験するほうが（やってるひと少ないですが）大切ではないでしょうか。

Image Jを用いたSDS-PAGEでのバンドの濃さの比較 削除/引用 No.7194-1 - 2018/09/03 (月) 10:14:24 - koh いつもおせわになっております。 SDS-PAGEでのタンパク量の比較をImage Jを用いて行いたいと思っております。 バンドを四角で囲って指定し、Plot Laneでピークを測定、直線でピークを囲って、魔法の杖ツールで面積を出す方法と、ROI Managerで見たいバンドを登録しておいて、MeasureでmeanやIntDenを比較する方法の２つがあるようですが、先生方はどちらの方法をお使いですか？ 試しに同じ画像をこの2つの方法で解析してみたところ、画像によっては3倍くらい結果が変わってしまったので、ご相談した次第です。 お時間ある時でいいのでご存知の方、是非ご教授下さい。 宜しくお願い致します。

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