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(無題) 削除/引用 No.7197-10 - 2018/09/29 (土) 18:25:05 - おじさん 例え短くても、中の配列によっては全長が合成出来ないことは多々ありますよ． No.7197-4 -774さんの方法と似ていますが、全長を上流側と下流側に分けてそれぞれのcDNAを合成して（一度何かのプラスミドに入れてから）ユニークな制限酵素サイトを使って合体する、ユニークな制限酵素サイトがなければ上流側と下流側を鋳型としてoverlap PCRすれば取れます．

(無題) 削除/引用 No.7197-9 - 2018/09/04 (火) 09:56:17 - AA qPCR用のcDNAを鋳型にされてたりしないですか？ 逆転写のやり方にも依りますが、例えばTakaraのprimescriptなどでは random hexmerを使って15分程度の逆転写反応時間が推奨されていたりします。 この条件だと完全長のCDSは逆転写されないので、どんなに頑張ってもクローニングはできないです。 Oligo-dTをつかって、伸長時間を伸ばす(15分を90分とか)ことで対応できます。

(無題) 削除/引用 No.7197-8 - 2018/09/04 (火) 08:59:33 - AP qPCRではランダムプライマーで逆転写するけどね。

(無題) 削除/引用 No.7197-7 - 2018/09/04 (火) 08:55:23 - AP 1. サイズはどれくらい？ 2. 雑多なcDNAのプールの中から標的cDNAを増やすような時に、いきなり付加配列のあるプライマーは難度が高い。一旦、普通のプライマーで増やしてから付加配列付きでPCRする。 3. 逆転写プライマーはoligo dTのみでしょうね？ ランダムプライマーだったりしない？

(無題) 削除/引用 No.7197-6 - 2018/09/04 (火) 08:52:00 - 774R 20塩基をもっと長くしてTm上げた方がいい

(無題) 削除/引用 No.7197-5 - 2018/09/04 (火) 08:40:17 - AP 1. サイズはどれくらい？ 2. 雑多なcDNAのプールの中から標的cDNAを増やすような時に、いきなり付加配列のあるプライマーは難度が高い。一旦、普通のプライマーで増やしてから付加配列付きでPCRする。 3. 逆転写プライマーはoligo dTのみでしょうね？ ランダムプライマーだったりしない？

(無題) 削除/引用 No.7197-4 - 2018/09/04 (火) 07:04:14 - 774 以前同じような状況になったことがあります。 ゲノムDNAからexon毎に増やしてつなげて行って、どうしても増やせなかった５’側の最初の30bpくらいはオリゴを作ってつなぎました。 全配列が既知の遺伝子だったので何とかなりました。 クローニング後はベクター側のプライマーセットでPCRがかかったので、プライマーのデザインがダメだったようです。 酵素はタカラのTks Gflexがいい印象で、増えない時はこれを使ってます。

(無題) 削除/引用 No.7197-3 - 2018/09/04 (火) 05:57:14 - ななしー 制限酵素処理する前にPCR産物精製かエタ沈してないとか

(無題) 削除/引用 No.7197-2 - 2018/09/04 (火) 02:23:39 - おお >ポリメラーゼの相性やプライマーのデザインでこういうことって結構ありますかね？ それはあると思います。少し内側のプライマーを作ってNested PCRするとか、cDNAを作るときにスペシフィックプライマーで作るとか、タッチダウンでPCRすると酵素を変更するとかかいくらかの工夫でうまくいくことがあります。 しかしながらｑPCRは全長を見ているわけではないので、qPCRでPCRがかかる以外のところの配列はわからないのであなたが思っている開始コドンなどがそのqPCRでかかるTranscriptsに存在するかは一度再考する必要があるかもしれません。 理研がマウスについては片っ端から全長のTranscriptsをプラスミドに入れてストックしていますのでそのデーターベースからqPCRでかかるTranscriptsを探してみるといいかもしれません。また、 EMBLでどんなTranscriptsが存在しうるのか一度確認してみるのも手かもしれません。

クローニングできないです。 削除/引用 No.7197-1 - 2018/09/04 (火) 02:10:54 - PCR マウス肝臓のcDNAから特定の遺伝子をクローニングしてpcDNA3ベースにぶちこみたいです。 Fwdプライマーには4つのどうでもいい塩基、BamH1、Kozak、ATGから始まる20塩基を付し、一方RevプライマーにはSTOPコドンを含めた20塩基、Not1、4つのどうでもいい塩基を付しています。 その遺伝子は肝臓にのみ発現しているもので（クッパー細胞）、ｑPCRでもそのようなデータを出せました。 ただ全長のクローニングがどうしてもうまくいかんです。 PfuUltraIIを使って、28と35サイクルを何度か試しましたが、全くバンドは出ず、ｃDNAも調製しなおしてもだめでした。ポリメラーゼの相性やプライマーのデザインでこういうことって結構ありますかね？ 全長は1.6ｋｂで、PCR条件は、 95℃、2分、（95℃20秒、50℃20秒、72℃50秒）ｘ28または35、72℃5分、12℃無限大です。 困りました。

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