Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

マウス血液フロー トピック削除
No.7223-TOPIC - 2018/09/12 (水) 00:13:00 - 最強の素人
マウス末梢血フローで困っています。具体的に言うと、末梢血中のT細胞ポピュレーションを見たいのです。

私はDC-Tcellをやっている者で、フローのサンプル調整とマシン操作自体には精通しているのですが、これまで末梢血中のフローを行った経験が学生時代の2回しかありません。その時の記憶を辿って行ってみたのですが、うまくいきませんでした。

プロトコールは以下です。
1.へパ化したシリンジ(20G)で頚静脈より採血
2.100 ulを分注し溶血処理(RT, 10min eBioscience RBC lysis bufferを1 ml使用)
3.RPMI(10% FBS)でwash
4.1500 rpm, 5 minで細胞回収
5.100 ul PBS (1% FBS) に懸濁
6.染色 (on ice 30 min,抗体量はvs 1 million cellで計算)
7.wash
8.analysis

という流れです。
そもそも、綺麗にLymphocyte populationがはっきり見れませんでした。溶血が強すぎたとは思えません。細胞自体は生きていました。また、とりあえずゲートをかけてCD3, CD4, CD8を見てみたのですが、シグナルがいずれかなり弱くはっきりしませんでした。抗体量が少なかったのでしょうか。

この手の経験が豊富な方、何が問題か、また、適切なプロトコールをご教授お願いできますでしょうか。
宜しくお願いします。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.7223-7 - 2018/09/13 (木) 06:28:24 - Mac
「綺麗にLymphocyte populationが見れない」というのが、forward/side scatter plotでの話であれば、マシンや解析条件の設定から確認した方が良いかもしれません。

マウスの胸腺、脾臓、リンパ節など、十分な細胞数が容易に得られ、その90%以上がリンパ球であるサンプルを用いて、forward/side scatter plotのどこにリンパ球が出るかを確認してから、末梢血のサンプルをかけて見てはどうでしょうか? 脾臓の場合は骨髄球系の細胞も5-10%くらい混じるので、好中球など末梢血にも存在する非リンパ球系の細胞の出方も確認できます。脾臓で出るpopulationが末梢血で出なければ、末梢血のサンプル調整の問題に絞る事ができます。

頸静脈血を使った事がなく、採血法に関してはコメントできませんが、ヘパリンコートのキャピラリーで採血した末梢血100 ulでB細胞、T細胞、好中球、単球は普通にフロー解析できます。通常のレシピの自作ACKバッファーを10倍量加えて溶血してますが、5分もあれば十分と思います。細胞のロスを避ける(というか単に横着なだけとも言えますが)ため、洗浄は最低限にしており、染色は室温で15分程度でやってます(氷冷すると混じっている血小板が活性化するので室温で、とかなり昔に習ったのですが、真偽のほどは不明です)。抗体量はかなり少なくても染まる印象で、業者が1 million細胞に推奨している量で足りない事はないと思いますよ。

(無題) 削除/引用
No.7223-6 - 2018/09/12 (水) 09:26:10 - TK-1
>[Re:5] 最強の素人さんは書きました :
> TK-1さん
>
> ありがとうございます。
> 最終的には全採血してGradientでリンパ球回収となると思います。その方が私的にも快適なのですが、マウス数が少ないようで、殺さずにスクリーニングかけている状態です。
100 ul の血液をPBS/EDTA 600ul くらいに採血して分離すればいいじゃないですか。なんで全採血なんか必要なんですか?血液を取る操作は同じですよ。

> 血液量は確かにリッチですね。もっと少なくてもいいと思いますが、今のラボの先人が100ulじゃないと見れないと言い張っておりまして…多いに越したことはないのですが、マルチカラーという方法を取っていないようです。
血液量じゃないですよ。その程度の数の細胞を100ulなんかで染める必要ないでしょう。抗体の無駄使いです。

(無題) 削除/引用
No.7223-5 - 2018/09/12 (水) 07:01:52 - 最強の素人
TK-1さん

ありがとうございます。
最終的には全採血してGradientでリンパ球回収となると思います。その方が私的にも快適なのですが、マウス数が少ないようで、殺さずにスクリーニングかけている状態です。
血液量は確かにリッチですね。もっと少なくてもいいと思いますが、今のラボの先人が100ulじゃないと見れないと言い張っておりまして…多いに越したことはないのですが、マルチカラーという方法を取っていないようです。

(無題) 削除/引用
No.7223-4 - 2018/09/12 (水) 06:58:26 - 最強の素人
まくさん

早速のご回答ありがとうございます。
Lysis bufferのマニュアルによると、100ulの全血に対して1mlで10分となっていました。ですが、5分で十分と思います。他のbufferは1分で十分なものもあるようですね。
Scatterについては調節していましたが、どうも的確に捉えられなかったと記憶しています。
実は、新しいラボへ移ったばかりで、サイトメーターの状況がよく分かっていません。フィルターの設定やレーザー軸などに問題があるのかもしれません。他の解析でも、どう見てもおかしいポピュレーションがありました。
サンプル自体の調整が問題なのではないのかもしれませんね。
今まさにサンプルを作っていました。今回は溶血はOKで細胞数も10^6に揃えたので、これを解析しておかしいようならば、サイトメーターの問題だと思います。

(無題) 削除/引用
No.7223-3 - 2018/09/12 (水) 06:54:53 - TK-1
リンパ球が主に見たいのなら、Ficollかそれに準ずる試薬でgradientで取ったらいかがですか。大した手間ではないです。100 ulで染めるとはリッチですね。

(無題) 削除/引用
No.7223-2 - 2018/09/12 (水) 02:06:48 - まく
マウス末梢血の溶血後のサンプルほとんどはリンパ球ですので染まらないはずはないと思います。

溶血バッファーに入れて10分も静置はプロトコル通りですか?
私は溶血バッファーを加えて軽く転倒混和したらすぐに遠心してます。
それで私の場合は十分です。

フローのscattered propertyがおかしいのかもですね。

マウス血液フロー 削除/引用
No.7223-1 - 2018/09/12 (水) 00:13:00 - 最強の素人
マウス末梢血フローで困っています。具体的に言うと、末梢血中のT細胞ポピュレーションを見たいのです。

私はDC-Tcellをやっている者で、フローのサンプル調整とマシン操作自体には精通しているのですが、これまで末梢血中のフローを行った経験が学生時代の2回しかありません。その時の記憶を辿って行ってみたのですが、うまくいきませんでした。

プロトコールは以下です。
1.へパ化したシリンジ(20G)で頚静脈より採血
2.100 ulを分注し溶血処理(RT, 10min eBioscience RBC lysis bufferを1 ml使用)
3.RPMI(10% FBS)でwash
4.1500 rpm, 5 minで細胞回収
5.100 ul PBS (1% FBS) に懸濁
6.染色 (on ice 30 min,抗体量はvs 1 million cellで計算)
7.wash
8.analysis

という流れです。
そもそも、綺麗にLymphocyte populationがはっきり見れませんでした。溶血が強すぎたとは思えません。細胞自体は生きていました。また、とりあえずゲートをかけてCD3, CD4, CD8を見てみたのですが、シグナルがいずれかなり弱くはっきりしませんでした。抗体量が少なかったのでしょうか。

この手の経験が豊富な方、何が問題か、また、適切なプロトコールをご教授お願いできますでしょうか。
宜しくお願いします。

7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。