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CsCl-EtBr密度勾配遠心におけるDNA濃度 トピック削除
No.7230-TOPIC - 2018/09/13 (木) 23:53:37 - n
はじめて塩化セシウム超遠心をしているのですが、バンドが広がっていて、oc, cccの区別が出来ません。

塩化セシウム、エチブロを加える前のDNA 溶液のDNA濃度は 65 μg/mLでした。

Molecular cloning を読む限り、50 mL LB培地で培養、プラスミド精製後、3 mL TE にDNAを溶解し希釈せず超遠心に用いていると解釈したのですが、実際そうした方が良いのですか?

今回は最終ボリュームをチューブの関係上多くせざるを得ませんでした。
また、パラフィンオイルは使っていません。
超遠心は200000 G , 20 hで行なっています。
 
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(無題) 削除/引用
No.7230-18 - 2018/09/21 (金) 02:15:57 - n
おおさん

CsCl超遠心のためにCsClも買っているのでできれば、超遠心でなんとかしたいところですが、ほかの教えて頂いた手も参考にしてみます。
ありがとうございます。

> OCがどれくらい混入しているかは一度電気泳動で確認してみればいいかとおもいます。

確認した上でCsCl超遠心を行なっているのですが、バンドが広がり 主に濃く見える領域を抽出してきても、遠心前と同じようにCCC以外に他のバンドも見えてしまいます。

(無題) 削除/引用
No.7230-17 - 2018/09/21 (金) 02:02:01 - n
からむさん


> 植物ならこれとカラムで余裕です

商品説明読みました。 すごいコンピですねえ!初めてこういうものの存在を知りました。
しかし、ヒト由来の細胞に限定されている内容でした。
(植物でも使えるかわかりませんでした。)

実際に植物(アラビのプロトプラスト)へのトランスフェクション用plasmid精製にこのコンピを利用されているのですか?

(無題) 削除/引用
No.7230-16 - 2018/09/19 (水) 06:51:31 - おお
https://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150303105755.htm

>>植物のプロトプラストは動物細胞よりエンドトキシンにセンシティブ...
>生物学的に興味をそそる。。レセプターは何だろうか。

こんなんみつけました。詳しい方いますか?

(無題) 削除/引用
No.7230-15 - 2018/09/19 (水) 05:16:46 - おお
あ、そうそうOCがどれくらい混入しているかは一度電気泳動で確認してみればいいかとおもいます。普通は大抵の精製方法ではそんなにOCは混じってないです。DEAEのカラムでも分離されるというのを読んだことがあるような気がするのでお使いのQuagenのキットもCCCに最適化しているのかもしれません(ここは想像ですけど)。

(無題) 削除/引用
No.7230-14 - 2018/09/19 (水) 05:11:41 - おお
QIAGENのmaxiprep purification kitはエンドトキシンフリーという謳い文句があるなら、DEAEカラムでDNAを吸着した状態でTritonX-100を含む溶液でLPSを洗い流すようになってるんじゃないかな。DEAEカラムは哺乳類の細胞で使えるほどにはきれいになっているけど、どうも更に精製するとロスはほとんどなくても沈殿させたときのボリュームがかなり減るので、なんだか入っているというという印象はありますね。

もしセシクロなしですますなら、いくらか試行錯誤がいるかも知れませんが、やって見る価値がありそうなのは
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2699240?dopt=Abstract
フルテキストで見れるサイトが見当たらなかったけど、、、

また個人的にきれいになるなと思っているほうほうは飽和ウレアとDNA溶液1:1でまぜてエタ沈(わたしはたいていNaAcetateをつかう。

(無題) 削除/引用
No.7230-13 - 2018/09/18 (火) 17:28:10 - からむ
植物ならこれとカラムで余裕です。

https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/luc-20130708-1.asp?entry_id=11322

(無題) 削除/引用
No.7230-12 - 2018/09/15 (土) 15:23:11 - n
MONさん

塩化セシウム超遠心も塩化セシウムが高いのでそこはネックです、、、

Triton X114ですね。 確認してみます!

PEG沈もやってみようと思います。


動物細胞はエンドトキシンフリーのprepキットで精製使用していますが、
植物ではそれではダメだと先生から聞きました。

先生の経験では、エンドトキシンがあるとプロトプラストが凝集してしまうそうです。

確かに機構が気になるところではありますね。


本当に色々ご指摘いただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.7230-11 - 2018/09/15 (土) 14:46:22 - mon
まあ、たしかに大きなお世話ですね。。
言い訳ですが、超遠心は標品に短いDNA?RNA断片が混ざるとも聞きました(どこかでSEM像を見たけど、カラム法の宣伝かもしれん)。
(分解した)RNAの混入は経験があります>PEG沈で回避。
EndotoxinはTriton X114でも除去できますけど、どちらが綺麗なんだろう。
また、Qiagenのキットは高価だし、カラム滓が出るし、時間がかかるし、収率が低いLotがあったり、でかなり前に使わなくなりました。今はさすがに改善したのだろうか。

>植物のプロトプラストは動物細胞よりエンドトキシンにセンシティブ...
生物学的に興味をそそる。。レセプターは何だろうか。

(無題) 削除/引用
No.7230-10 - 2018/09/15 (土) 00:01:37 - n
APさん

ご回答ありがとうございます。

まずできることとして 超遠心時間を伸ばしてみることにしました。

私もcccの件は 先生から聞いた話で実際に実験をしたり、そうゆう論文を漁ったりしているわけではないので、確定は出来ません。

(無題) 削除/引用
No.7230-9 - 2018/09/14 (金) 20:34:52 - AP
条件が適当かどうか判断できかねますが、
分離が不十分ということであれば、先ず遠心時間の不足を疑います。
できれば倍くらいに伸ばしてみては。
体積をスケールアップしているので(実際には液面から底までの距離が増えてるのが問題ですが)、濃度勾配の平衡に達するまでに余計に時間がかかります。

カラムマトリックス法ですが、よくあるシリカマトリックスのものであれば、やはり超遠心法には及びません。試薬や手順を加えてエンドトキシンフリーにする製品なんかもありますが。

本当に「イオン交換樹脂」タイプのものであれば(Qiagen tipのような)セシウム超遠心法に匹敵するといわれていますし、毒性も超遠心並みに低減します。ただ、やっぱり精製品の性状(粘性や目に見える不溶物など)を見るとセシウム法のほうが夾雑物が少ない印象です。

超遠心とイオン交換樹脂、どっちがいいかはそれぞれの事情(超遠心機などの設備状態、消耗品類の備蓄状態や消耗品予算とか)や好みによるとしか言いようがない。どっちがいいとかは余計なお世話かも。

CCCのほうが形質転換効率が上がるといいますが、ちゃんと検討した人はいるんでしょうかね? 何度もやっているうちにCCCが少ないときは「効率が悪かったような気がする」ってだけじゃないですかね。本当にCCCの割合に依存するのか、そのときどきの精製の出来不出来による他の要因はないのか?
ニックが入ったくらいなら宿主細胞(核)で修復されるでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.7230-8 - 2018/09/14 (金) 19:23:41 - n
Monさん

cccの方が形質転換効率が上がること、
そして一番の理由は、イオン交換カラム法ではエンドフリーキットでもエンドトキシンを除くことが難しいため、です。

植物のプロトプラストは動物細胞よりエンドトキシンにセンシティブで、CsCl超遠心で精製するしかないと聞いております。


知識不足で申し訳ないです。

(無題) 削除/引用
No.7230-7 - 2018/09/14 (金) 18:28:38 - mon
maxiprep等のイオン交換カラム法で精製していれば、超遠心する必要はないでしょう。
かえって品質を落とす原因になると思います。
超遠心でCCCを分離精製しても、作業中にNickが入り、ある程度のOCができるので、CCC/OC比はカラム法と大差ないと思います。
なお、RNaseで分解したRNA断片は短すぎて電気泳動では確認できません。
カラム法で精製した標品のどこが問題なのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.7230-5 - 2018/09/14 (金) 11:39:09 - n
ご回答ありがとうございます。

Monさん

QIAGENのmaxiprep purification kit を用いて精製しました。
https://www.qiagen.com/it/resources/download.aspx?id=4db48eae-cb5c-434e-bcd9-a415664ecc46&lang=ja-JP

変性溶液にRNaseを加えているので、(また、アガロース電気泳動で確認済みなので)、
RNAのコンタミはないと考えています。

かなり大量のDNAを一気に精製出来るのですね?
教えてくださりありがとうございます。

密度は1.55になるようにしていますが、
誤差は、超遠心3回で最大±0.05ほどありました。

ご指摘通り、アングルローターで行っているので、
遠心時間と遠心力の検討もしてみます。

シロイヌナズナのプロトプラストにpeg法で
トランスフェクション(>レポーターアッセイ)に使うDNAを精製するために超遠心を行なっています。


丁寧で分かりやすいご回答をいただき本当にありがとうございます。
参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用
No.7230-4 - 2018/09/14 (金) 10:39:24 - mon
>プラスミド精製後
どの程度ですか?アルカリSDS>EtOHppt程度?
RNAが多いとRNA/EtBr/セシウム沈殿が生じ微妙に有効塩化セシウムの濃度が変わって分離が悪くなることがあります。私は、RNase処理>PEG沈殿でRNAを除去してから超遠心していました。
塩化セシウムの濃度は厳密に合わせないと密度が変わり、ocとcccは分離しません。
そのため、manualの液量は正確に守りましょう。
DNA濃度はある程度(2mg/mLだったかな?)まで許容できます(量が多いとバンドが太くなる、少ないとUVmダメージが気になる)。
>バンドが広がっていて
遠心時間(x遠心力)が足りない可能性もあります。アングルローターはバーティカルローター(チューブが遠心方向に対して垂直)にくらべ、移動距離が長くなりますので遠心時間は長くなります。
12 mLチューブ(直径12mm位かな)だと、ocとcccは5〜10mmほど離れたような(懐かしい)。。
コストが高いことや廃液処理・作業が面倒なので近年はplasmid精製に超遠心はほとんど使われませんが、よろしければ目的を教えてください。

(無題) 削除/引用
No.7230-3 - 2018/09/14 (金) 00:35:32 - n
説明不足で申し訳ありません。

チューブには、12 mL入ります。

(無題) 削除/引用
No.7230-2 - 2018/09/14 (金) 00:11:48 - AP
>今回は最終ボリュームをチューブの関係上多くせざるを得ませんでした。

どれくらい多くしたのだろうか? 体積が大きいほど分離に要する超遠心時間は長くなります。

CsCl-EtBr密度勾配遠心におけるDNA濃度 削除/引用
No.7230-1 - 2018/09/13 (木) 23:53:37 - n
はじめて塩化セシウム超遠心をしているのですが、バンドが広がっていて、oc, cccの区別が出来ません。

塩化セシウム、エチブロを加える前のDNA 溶液のDNA濃度は 65 μg/mLでした。

Molecular cloning を読む限り、50 mL LB培地で培養、プラスミド精製後、3 mL TE にDNAを溶解し希釈せず超遠心に用いていると解釈したのですが、実際そうした方が良いのですか?

今回は最終ボリュームをチューブの関係上多くせざるを得ませんでした。
また、パラフィンオイルは使っていません。
超遠心は200000 G , 20 hで行なっています。

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