Bio Technical フォーラム

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トランスフェクションしたMMPの分泌について トピック削除
No.7231-TOPIC - 2018/09/14 (金) 00:59:33 - ああ
いつも勉強のために拝見させていただいております。

前回はMMPのTet-offシステムによる安定発現株樹立の際、ドキシサイクリンの有無で遺伝子発現に差がなく困っておりましたが、皆さんのアドバイスのおかげで、DNase処理を行うことでRNAの発現レベルにおいて、ドキシサイクリンの有無で12倍ほど差がある株を樹立できました。
その節はありがとうございました。

このMMPは分泌型なので、現在その培養上清を使用し、Casein ZymographyやWestern blotなどでMMPの発現を確認しているのですが、ドキシサイクリンの有無で違いが無く、困っております。

現在のプロトコールを記載いたします。
1.Tet-offシステムの安定発現株を100 mm dishでサブコンフルエントまで培養(このときの培地は、DMEM+10%FBS+ドキシサイクリン)
2.トリプシン-EDTAで細胞を剥がし、遠心にて細胞塊を作成
3.PBS(-)を入れ、細胞塊を懸濁し、遠心にて細胞塊を作成
4.Step.3をもう一度繰り返す。
5.ドキシサイクリン無添加のDMEM+10%FBSで細胞を懸濁後、細胞を6 well plate中の2 well に播種(残りはstock用に別培養)。このときあらかじめ、一方にはドキシサイクリンを添加、もう一方は無添加のDMEM+10%FBSを2mL入れておく。
6.4-6時間後、細胞がwell底面に付着したことを確認し、PBS(-)で2回洗浄
7.DMEM+10%FBSにドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、洗浄後の細胞にそれぞれ加える
8.細胞がサブコンフルエントになった時点でDMEMにFBSを加えていないものに、ドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、PBS(-)で2回洗浄後、それぞれの群に加える
9.72時間後に培養上清を回収し、遠心で細胞を除去したのち、スピンカラムで濃縮し、Casein ZymographyやWestern blotに使用。

Casein Zymographyのサンプル調整の際には、還元剤と95℃の熱を加えておりません。また、ネガティブコントロールとして、developmentの時点で一方には10 mMのEDTAを添加しています。developmentの温度と時間は37℃、48時間です。白抜けのバンドはあるのですが、ドキシサイクリンの有無で差が無いこと、およびネガティブコントロールでも出ているので、おそらくMMPでは無いであろうという結論に至っています。

またWestern blotに関しては、当方の使用しているMMPを検出する良い抗体が販売されていないようで、MMPの末端にHA-tagがついているコンストラクトを使用しているので、HA-tagの検出を行っております。バンドは出るのですが、こちらもドキシサイクリンの有無で差が無いこと、および予想しているバンドサイズではないため、これもMMPでは無いであろうという結論に至っています。

本来はELISAが一番適当だと思うのですが、良い抗体が無い関係で行っておりません。

そこで質問なのですが、RNAで発現していても、細胞によってはできたタンパク質が分泌されないことは考えられるでしょうか。もしくはプロトコール中で改善すべきポイントはあるでしょうか。

私個人的には、現在使用している細胞に、トランスフェクションしたタンパク質(今回はMMP)を細胞外へ輸送する経路が無いのではないかと愚考しております。

かなり長文になってしまいましたが、現在かなり困っております。
その方面に明るい方が居られれば、何かしらアドバイスやご意見を頂ければ幸いです。

よろしくお願い申し上げます。
 
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(無題) 削除/引用
No.7231-5 - 2018/09/15 (土) 04:09:53 - ああ
おお様

ご回答ありがとうございます。
当方が誤解しておりました。訂正していただきありがとうございます。

確かにそれは良い考えですね!
早速、抗体を調べてみます。

(無題) 削除/引用
No.7231-4 - 2018/09/15 (土) 03:23:49 - おお
>また、HE-stainingも行ってみます。

あ、言葉足らずで、、、
Anti-HAでImmunostainingをしたらどうかと、、、

(無題) 削除/引用
No.7231-3 - 2018/09/14 (金) 23:57:21 - ああ
おお様

すばやいご回答ありがとうございます。
良いアドバイスを頂き、併せてお礼申し上げます。

ちょうど現在、6 well plateで培養している細胞があるので、まずはcell lysateを調整して、おお様のアドバイスを基にwestern blotを行ってみます。

また、HE-stainingも行ってみます。
何かわかりましたらこのトピックに再度返信いたします。
その際はさらにご助言頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用
No.7231-2 - 2018/09/14 (金) 10:16:19 - おお
HAで染めてみてはどうでしょうか。細胞表面に出てくるけど放出されないとかいろいろ情報が得られるかもしれません。また細胞のLysatesをWBすることによって発現は確認できるのでは?

トランスフェクションしたMMPの分泌について 削除/引用
No.7231-1 - 2018/09/14 (金) 00:59:33 - ああ
いつも勉強のために拝見させていただいております。

前回はMMPのTet-offシステムによる安定発現株樹立の際、ドキシサイクリンの有無で遺伝子発現に差がなく困っておりましたが、皆さんのアドバイスのおかげで、DNase処理を行うことでRNAの発現レベルにおいて、ドキシサイクリンの有無で12倍ほど差がある株を樹立できました。
その節はありがとうございました。

このMMPは分泌型なので、現在その培養上清を使用し、Casein ZymographyやWestern blotなどでMMPの発現を確認しているのですが、ドキシサイクリンの有無で違いが無く、困っております。

現在のプロトコールを記載いたします。
1.Tet-offシステムの安定発現株を100 mm dishでサブコンフルエントまで培養(このときの培地は、DMEM+10%FBS+ドキシサイクリン)
2.トリプシン-EDTAで細胞を剥がし、遠心にて細胞塊を作成
3.PBS(-)を入れ、細胞塊を懸濁し、遠心にて細胞塊を作成
4.Step.3をもう一度繰り返す。
5.ドキシサイクリン無添加のDMEM+10%FBSで細胞を懸濁後、細胞を6 well plate中の2 well に播種(残りはstock用に別培養)。このときあらかじめ、一方にはドキシサイクリンを添加、もう一方は無添加のDMEM+10%FBSを2mL入れておく。
6.4-6時間後、細胞がwell底面に付着したことを確認し、PBS(-)で2回洗浄
7.DMEM+10%FBSにドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、洗浄後の細胞にそれぞれ加える
8.細胞がサブコンフルエントになった時点でDMEMにFBSを加えていないものに、ドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、PBS(-)で2回洗浄後、それぞれの群に加える
9.72時間後に培養上清を回収し、遠心で細胞を除去したのち、スピンカラムで濃縮し、Casein ZymographyやWestern blotに使用。

Casein Zymographyのサンプル調整の際には、還元剤と95℃の熱を加えておりません。また、ネガティブコントロールとして、developmentの時点で一方には10 mMのEDTAを添加しています。developmentの温度と時間は37℃、48時間です。白抜けのバンドはあるのですが、ドキシサイクリンの有無で差が無いこと、およびネガティブコントロールでも出ているので、おそらくMMPでは無いであろうという結論に至っています。

またWestern blotに関しては、当方の使用しているMMPを検出する良い抗体が販売されていないようで、MMPの末端にHA-tagがついているコンストラクトを使用しているので、HA-tagの検出を行っております。バンドは出るのですが、こちらもドキシサイクリンの有無で差が無いこと、および予想しているバンドサイズではないため、これもMMPでは無いであろうという結論に至っています。

本来はELISAが一番適当だと思うのですが、良い抗体が無い関係で行っておりません。

そこで質問なのですが、RNAで発現していても、細胞によってはできたタンパク質が分泌されないことは考えられるでしょうか。もしくはプロトコール中で改善すべきポイントはあるでしょうか。

私個人的には、現在使用している細胞に、トランスフェクションしたタンパク質(今回はMMP)を細胞外へ輸送する経路が無いのではないかと愚考しております。

かなり長文になってしまいましたが、現在かなり困っております。
その方面に明るい方が居られれば、何かしらアドバイスやご意見を頂ければ幸いです。

よろしくお願い申し上げます。

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