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(無題) 削除/引用 No.7267-10 - 2018/10/06 (土) 12:36:50 - おお >ゼラチンコートが推奨されており、 昔岩城硝子から安いゼラチンかコラーゲンのコートされたものを買ったのを覚えている。自前でばらつきが出そうならそういうのでもいいのではないかと、やすければ。 ただ、どこまでロット間でばらつくかは生産、品質管理によるので最初は様子見が必要かもしれない。 グルタミンなどアミノ酸はだんだん分解してアンモニアが発生して細胞に毒性をもたらすらしいし、やはり長期間おいておいた培地は変なことが起こりやすいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.7267-9 - 2018/10/06 (土) 12:20:29 - mon PNさんの答えは、チロシンの光分解かな？

(無題) 削除/引用 No.7267-8 - 2018/10/04 (木) 14:28:05 - 茶 みなさま 回答有り難うございます。 現在、100mmディッシュから60mmディッシュに変えて培養を続けているところです。 100mmを使用していたときよりもやや軽減されたとは思いますが、継代のたびに勢いが失われているように思います。 みなさまからあったように培養液の購入の相談をしたいと思っております。 PNさん Yですか…もう少しヒントをお願いします。 monさん、えdrhyjぬkさん 以前購入したものが数本残っており、それを使えればそれでという指示があったため使用しておりました。 新しいものを購入できないか相談してみたいと思います。 おおさん 以下4点を加えました。 - 0.5 ML FGF - 5.0 ML L-Glutamine - 5.0 ML Antibiotic-Antimycotic Solution - 50.0 ML FBS ＞ゼラチンコートなくても線維が細胞なら増殖すると思うけど、、、何か目的があるのかな、、、 メーカーのマニュアルでゼラチンコートが推奨されており、試しにゼラチンコートなしで培養したこともあるのですがなかなか接着できないようで育てることができませんでした。 ＞shelf lifeは確認しましたか？３年ってちょっと長いなってきがします。 4℃保存で2ヶ月保存可能で、期限切れは理解した上で使用しておりました。購入できないか相談してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7267-7 - 2018/09/29 (土) 11:59:43 - えdrhyjぬk 直接の原因かどうかはわかりませんが、実験の前提として使用期限を過ぎている培地は使わないようにしましょう。培地成分の中には不安定な物質（分解したり、分解するだけじゃなくて細胞に悪い副産物生じたり、酸化されたりetc)も含まれていますので、そうしたことを踏まえた上で使用期限が設けられています。培地の劣化の影響は細胞にも大きく依存しますので、あの細胞ではOKだったからこの細胞も、という訳にはいきません。3年は確実に古過ぎでヤバい水準です。 こうした条件の元でも細胞が上手く育つときの方が問題はやっかいで、データにも影響を与えるおそれがあります。

(無題) 削除/引用 No.7267-6 - 2018/09/29 (土) 00:43:04 - おお >3年ほど前 shelf lifeは確認しましたか？３年ってちょっと長いなってきがします。

(無題) 削除/引用 No.7267-5 - 2018/09/28 (金) 02:35:08 - おお ＞・ゼラチンコート方法の変更 ゼラチンコートなくても線維が細胞なら増殖すると思うけど、、、何か目的があるのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.7267-4 - 2018/09/28 (金) 02:31:54 - おお でSupplemenｔは何を加えたの？ Fibroblast Medium Supplement Kit, Cat No M2267-Kit includes: - 0.5 ML FGF - 0.5 ML Hydrocortisone - 5.0 ML L-Glutamine - 5.0 ML Antibiotic-Antimycotic Solution - 50.0 ML FBS *Before use, add M2267 Supplement Kit (M2267-Kit) into 500ml basal medium. http://www.cellbiologics.net/index.php?route=product/product&path=3_131&product_id=2384

(無題) 削除/引用 No.7267-3 - 2018/09/27 (木) 12:28:11 - mon 培地の保存状態が不明ですが、グルタミンがへばったとか？ （PNさんの答えが分からない。。）

(無題) 削除/引用 No.7267-2 - 2018/09/27 (木) 12:21:01 - PN ヒント。Yです。

継代を2代ほど続けると細胞が死んでいく 削除/引用 No.7267-1 - 2018/09/27 (木) 10:59:36 - 茶 細胞実験を始めたばかりで勉強不足なところも多々あると思いますが、よろしくお願いします。 凍結保存された第2世代の肺線維芽細胞を融解し、2代ほど継代するとどんどん細胞が弱り、しまいには死んでしまいます。融解したときには、1.0×10^6ほどの細胞が生きています。 今後の実験のため、第4世代くらいのストックを大量に作りたいと思っているのですが、うまくいかない状況です。 培養液は細胞を購入したメーカーの推奨メディウム（増殖因子入り）を使用しています。 気をつけた点は以下のとおりです。 ・ピペッティングの回数を少なくする ・37℃インキュベーターで温めたメディウムを用いる ・ゼラチンコート方法の変更（風乾をしていましたが、風乾をするとムラになるという記述を2つほど見かけたので風乾をしない） これまで皮膚の線維芽細胞、肺胞の上皮細胞、肺の腺癌細胞の培養を行ってきましたが、このようにうまくいかなかったのは初めてです。 なにかアドバイスをいただけると幸いです。どうぞよろしくお願い致します。 使用している細胞 Cell Biologics社のC57BL/6 MOUSE PRIMARY LUNG FIBROBLASTS 使用している培養液 Cell Biologics社のCOMPLETE FIBROBLAST MEDIUM /W KIT – 500 ML（3年ほど前のもので管理は適切でした。現在の商品と異なり、0.5 ML Hydrocortisoneが含まれていません）

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