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(無題) 削除/引用 No.7275-10 - 2018/10/01 (月) 08:07:20 - 金 ありがとうございます。 ちなみにこのタンパク質は2型なのですが、C末にmycフラグタグがついていますので、おそらく細胞外にタグが出ているんでしょうね。 ちなみにエンドの抗体でFACSしたところ検出はできませんでしたが、タグの抗体では検出したことはまだないです。 オリジーンは不思議で、始め、ここから購入予定でしたが500ドルほどしていたのでやめたんです。 けど時間が経ってからサイトをまた見たら50ドルにディスカウントされていました。 GFPバージョンは今でも500ドル。人のmycDDKタグのものも500ドルとなぞですね。 ちなみにアドジーンからも購入したりしますが、MTA等の処理で2週間ほどかかって最近はあまり利用していませんね。

(無題) 削除/引用 No.7275-9 - 2018/10/01 (月) 08:01:36 - おお >ところでOriGeneは作ったすべてのクローンでFLAGで検出できるかバリデーションをしているんでしょうか？ OriGeneが自身で何らかの細胞に入れてFLAGで確認していれば検出系など見直す必要があるのかもしれないとおもう一方、そうでなければ実際Full lengthが発現していても、その後プロセッシングなど起こってい可能性も否定できないということです。 ＞オリジーンでなんと48ドル 最近はかなりのｃDNAがプラスミドに入れられて公的機関をふくめいろいろなところから手に入れることができます（ヒトやマウスならほぼすべて出回っているといってもいいかもしれません）。なのでまずプラスミドが出回ってないか調べるのも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.7275-8 - 2018/10/01 (月) 05:39:33 - 金 >ところでOriGeneは作ったすべてのクローンでFLAGで検出できるかバリデーションをしているんでしょうか？ どうでしょうか。ただ基本はmyc-DDKタグとEGFPタグバージョンが売られています。 ひょっとしてEGFPでは？と思いましたが、分子量から鑑みると違うみたいです。 膜はPVDFですね。NC膜はラボにはなさそうです。 確かにmycで出るかどうかは検討すべきですが、エンドの抗体がウエスタンでワークすることが確認されたので、そこまで掘り下げる必要はないかと考え中です。シークエンスはもちろんしてみます。 実はこの遺伝子はせいぜい1.5kbほどのタンパク質で肝臓に豊富に発現しているにもかかわらず、クローニングがうまくいきませんでした。PCRが全くかからず。それで2週間ほど時間を捨てていましたが、オリジーンでなんと48ドルで売られていたので迷わず購入しました。本当ラッキーでした笑

(無題) 削除/引用 No.7275-7 - 2018/10/01 (月) 05:20:41 - おお Mycで検出できるか見てみてもいいかもしれません。C末がタンパクが出来た後プロセッシングされる場合もあるかもです。 膜にニトロセルロースを使っていたらPVDFまたはその逆で一度やってみてもいいかもしれません。そういうちょっとした違いで検出がうまくいかなかったりというのがごくまれですがあります（これは構造に起因するものなのかもしれません）。

(無題) 削除/引用 No.7275-6 - 2018/10/01 (月) 05:14:53 - おお ところでOriGeneは作ったすべてのクローンでFLAGで検出できるかバリデーションをしているんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7275-5 - 2018/10/01 (月) 04:37:58 - 金 ありがとうございます。 そうですか。 ではプラスミドがおかしいかもですね。 一度しーけんすしてみます。

(無題) 削除/引用 No.7275-4 - 2018/09/30 (日) 19:26:23 - おお 変性させて、変性状態で泳動してトランスファーしているからないという人がたいていだと思います。 絶対にないかというといくらかの理由でそうとまで思ってないというのはありますが、他の考えうる可能性のほうがもっと高いのではとおもいます。

OriGeneのmyc-DKKプラスミドについて。 削除/引用 No.7275-1 - 2018/09/30 (日) 14:04:51 - 金 こんにちゎ。 件名のメーカーからある膜タンパク質をコードする遺伝子のプラスミドを買いました。 これにはC末端にmyc-DKKタグが付いていて、コス細胞に過剰発現させ、ウエスタンをしたところ、そのタンパク質に対する抗体ではガツンとバンドが出ましたが、Flag抗体ではバンドが出ませんでした。flag付きの別のタンパク質を発現させたライセートではバンドが出るので抗体はおっけー、プラスミドもおっけー、トランスフェクション、サンプル調製もおっけーです。 立体障害でflagが認識されないなんてことはあるのでしょうか？

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