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(無題) 削除/引用 No.7327-7 - 2018/10/19 (金) 11:32:30 - asan 回収したmedium中の全タンパク量には変化がないのか、メディウム中に変性したタンパク質がより選択的に容器に吸着しやすい傾向があるとかそういうのはあるかもしれませんね。 FBSの成分ってそもそもかなりアバウトなので、中には分解活性を持ってる様なものが存在するかもしれませんね。 自分がそういう研究をやるなら、WBよりもまずはGFPとか時間経過とともに直接確認できるもので試してみようかなとは思います。

(無題) 削除/引用 No.7327-6 - 2018/10/19 (金) 02:31:21 - おお N末に対する抗体、C末に対する抗体がそれぞれペプチドに対して作った抗体ならそのエピトープが切断されるだけでバンドが見えなくなるよ。 まあでも吸着は最初に可能性を潰しておいたほうがいいかな。 同時にプロテアーゼインヒビターを加えたDMEM、FBS 0.5％を並行してやっておけばある程度結論が出るかもしれない

(無題) 削除/引用 No.7327-5 - 2018/10/19 (金) 00:06:34 - aa mozさん、私もさん、おおさん、ありがとうございます。 まとめると、メディウムそのものにはタンパク分解を促すようなものはないだろうが、FBSにはあるかもしれない、また、おおさんの説明でいうとリコンビナントタンパクそのものにも含まれている可能性がある、とうことになるでしょうか。 自分の感覚で言うと、仮に純粋なタンパクだけであっても、37Cでインキュベートしたら時間と共に自然に崩壊が起こるだろうからバンドが薄くなっていくのはまあごく自然なこと、と思っていました。それで、疑問点としては、なぜ分解途中を反映したと思われるバンドが見られないのか？でして、 >分解の中間産物が見えないのは抗体にもよるかもしれませんがCell lysateなどを使った系ではまあまあありえます。 なぜ見えないのだろうか？という疑問が今も残っています。Caspaseなんかの酵素的に切られるものはcleaved Caspaseといった形で見られるのは知っているのですが。 実は、細胞有りで同様の実験もしていまして、細胞有りでは目的タンパク質よりも小さいサイズのバンドも見られ、時間と共に濃くなっていくのです。それで、これは細胞表面にある何かによって切断された結果現れたバンドではないか？ということで実験を進めており、まず、これが細胞無しでは起こらないことを示す為にトピックにあげた実験をやってみました。期待通りの結果とも言えるのですが、バンドが薄くなった分はどこにいったのか？という点で腑に落ちず質問させていただいた次第です。 薄くなった分はプレートへの吸着の結果の可能性があるという指摘は納得です。取りあえず低吸着のチューブを購入したので、プレート、普通のチューブ、低吸着チューブそれぞれを使って同じ実験をして、バンドの減弱具合が変わるかどうか調べてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7327-4 - 2018/10/18 (木) 06:43:48 - おお わたしも吸着を一つの可能性として疑いますが（特に培養用のDishなどは電荷を持たせて蛋白吸着しやすくしている）、 その他だと血清のプロテアーゼ成分による分解や、そのリコンビナントと一緒の挙動で精製された分解酵素などによるものも否定できないとおもいます。 分解の中間産物が見えないのは抗体にもよるかもしれませんがCell lysateなどを使った系ではまあまあありえます。

(無題) 削除/引用 No.7327-3 - 2018/10/18 (木) 05:34:23 - 私も 私も吸着を疑いましたね。 FBS中にはMMPなどザイモジェンがたくさんありますよ。 ウエスタンではなく、もういっそCBBで見たらいかがでしょうか。もちろんFBSを加えないで。 あるいはディッシュではなく、低吸着チューブ内で反応させたり。

(無題) 削除/引用 No.7327-2 - 2018/10/18 (木) 05:15:37 - moz 2）培地の組成をみれば分かりますが、proteolysis活性はないでしょう。 もしかしたらMg2+等のイオンが触媒として自己分解？を促進しているかもしれませんが。 FBSにはトリプシンインヒビター活性はありますが、他のProtease活性が無いとは言えません。でも高タンパク溶液なので、目的タンパクだけが分解されると考えるのは、難しいですね。 1）となると、目的タンパクの性質は不明ですが、FBSがブロッキング剤として働いているにもかかわらず、dishに吸着しているのではないでしょうか。dish素材のPSは元々タンパクを吸着しやすいので。 試供品で？低タンパク吸着のチューブをもらって試してみてはいかがでしょうか。

タンパクが壊れる時のパターン 削除/引用 No.7327-1 - 2018/10/18 (木) 04:26:53 - aa 研究対象のリコンビナントタンパクを細胞培養メディウム（普通のRPMI1640やDMEMにFBSを0.5％程度足したもの）に添加（念のため、これは細胞に添加したわけでは無いです。細胞無しの空のディッシュにメディウムを入れ、そこにリコンビナントタンパクを添加しました）して、細胞培養インキュベーターに入れ、4、8、12、24時間で回収しアセトン沈殿でタンパクを抽出しました。 これをSDS-PAGEに流して、対象タンパク質に対する抗体でWBしたところ、時系列に沿って対象タンパクのバンド約100kDaが徐々に薄くなっていくのが確認されました。 ここで質問なのですが、 1）バンドはかなり綺麗なシングルバンド（さすがに露光時間を1時間とかにすればnon-specificと思われるバンドがうっすら出てきますが）でした。壊れかけ、degradationしている最中と思われるバンドというのは全然確認できませんでしたが、これは普通のことなのでしょうか？目的のサイズよりも小さい壊れかけのバンドが見られても不思議では無い様に思えるのですが、そういうバンドは全く見られませんでした。N末に対する抗体、C末に対する抗体の2種類を試しましたが、結果は同じでした。 2）細胞培養メディウムそのものがproteolysis活性を持つかどうかご存知のかたおられますか？調べてみましたが、特にそういう活性があるとは出てきませんでした。おそらく無いはずと思っているのですが……。 かなり要領を得ない質問だと思いますが、ご存知の方おられましたらよろしくお願いします。

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