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長いインサートをBACへ挿入するコツはありますか トピック削除
No.7334-TOPIC - 2018/10/20 (土) 02:31:59 - なななのね
いつも勉強させていただいています。

Red/ETシステムを用いたBAC編集を行っております。約9kbのインサートをあるBACへ相同組換えさせたいのですが、なかなかうまくいきません。

BACは2-3kbpのインサート+homology arm 60bpであれば相同組換えできることは確認できているBACです。インサートのhomology armはN末端が140bp、C末端が90bp（インサートをPCRではなく平滑末端制限酵素で切断して作成している都合上、N末端とC末端でarmの長さが異なります）です。エレポ条件は1800V, 25µF, 200Ωです。
インサートを500ngまで増量したり、エレポ後のprecultureを70分から4時間へ延長したりといった検討も行いましたが、当たりのコロニーは得られませんでした。

このように長いインサートをBACへ相同組換えする際にはコツがあるのでしょうか。ないしは、そもそも9kbのインサートが長すぎて組換え自体が難しいのでしょうか。

どなたかご存知でしたら、ぜひ教えていただきたいです。よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.7334-7 - 2018/10/24 (水) 07:06:28 - なななのね
>>sさん
ご丁寧にいろいろ教えていただき、ありがとうございます。

おっしゃるように、200kbpですので、やはり都合よく切れるところはなく…。難しいところです。

(無題) 削除/引用
No.7334-6 - 2018/10/24 (水) 06:53:53 - s
>なななのね さん

200kbpですか。。それはエレクトロポレーションじゃないと厳しそうですね。
NEBuilderやin-fusionではvectorはlinearにしないとだめですね。

NEBuilderは相同組換えというよりも、3種類の酵素の組み合わせです。詳しくはGibson assemblyの論文に書いてあります。

200 kbpだと、inverse PCRで増やすのは当然無理なので、uniqueな制限酵素サイトがあればNEBuilderでもいけますけど、そんなのないですよね。。。

(無題) 削除/引用
No.7334-5 - 2018/10/23 (火) 20:09:18 - なななのね
>>sさん

ありがとうございます。BACは20万bp程度のものになります。

重ね重ねの基本的な質問で恐縮ですが、NEBuilderを用いるとtargetの部分の相同組み換えも起こるのでしょうか。
NEBuilderやIn-fusionなどでクローニングする際には、入る側のvectorをlinearにする必要があるように思ったのですが、BACなどの長いベクターの場合はそれも難しいのではないでしょうか。ないしはcircleのままでもよいのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7334-4 - 2018/10/22 (月) 18:12:16 - s
なななのねさん

BAC側をinverse PCRで増やしたり、十分量用意できるのなら、ケミカルコンピテントセルで十分だと思います。
普通のDH5alphaなどでも可能だと思います。

もとのBACのサイズにも依りますが。

(無題) 削除/引用
No.7334-3 - 2018/10/22 (月) 14:30:12 - なななのね
>>sさん

ありがとうございます。
導入はエレポでされたということでよかったでしょうか。NEBuilderでエレポのプロトコルは記載がありますね。この試薬でエレポすることも考えてみます。

おっしゃるように、9kbはそこまで大きくはないように思っていたのですが、なかなかうまくいかず、難しいですね。

(無題) 削除/引用
No.7334-2 - 2018/10/20 (土) 16:46:57 - s
13 kくらいのDNAをNEBuilderでBACに入れた経験がありますが、そんなに特殊なことしませんでした。
コンピも普通のケミカルでしたし。

長いインサートをBACへ挿入するコツはありますか 削除/引用
No.7334-1 - 2018/10/20 (土) 02:31:59 - なななのね
いつも勉強させていただいています。

Red/ETシステムを用いたBAC編集を行っております。約9kbのインサートをあるBACへ相同組換えさせたいのですが、なかなかうまくいきません。

BACは2-3kbpのインサート+homology arm 60bpであれば相同組換えできることは確認できているBACです。インサートのhomology armはN末端が140bp、C末端が90bp（インサートをPCRではなく平滑末端制限酵素で切断して作成している都合上、N末端とC末端でarmの長さが異なります）です。エレポ条件は1800V, 25µF, 200Ωです。
インサートを500ngまで増量したり、エレポ後のprecultureを70分から4時間へ延長したりといった検討も行いましたが、当たりのコロニーは得られませんでした。

このように長いインサートをBACへ相同組換えする際にはコツがあるのでしょうか。ないしは、そもそも9kbのインサートが長すぎて組換え自体が難しいのでしょうか。

どなたかご存知でしたら、ぜひ教えていただきたいです。よろしくお願いします。
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