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Fc融合タンパク質でのプルダウン、質量分析について。 トピック削除
No.7365-TOPIC - 2018/11/01 (木) 13:04:48 - Fc
一つ質問させてください。

この度、ヒトIgG2Fcの融合タンパク質を作製しまして、これを用いて相互作用する分子をマウス胎児ライセートからプルダウンし、結合タンパク質を質量分析にて同定したいと考えています。

私はこの手の実験は初めてなもので、プルダウンのニュアンスをどう考えたらよいのか悩んでいます。

例えば50ugほどのFc融合タンパク質をプロテインGビーズ(50ul分ほど)と混和後、そこへライセートを流してプルダウンし、ビーズを洗浄後、SDSサンプルバッファーで溶出を考えていましたが、

ある論文ではガラス製か何かの円柱状のカラムにビーズを充填し、そこへライセートを入れ、洗浄後、溶出バッファーでmlオーダーで溶出するというものでした。

おそらく前者であれば1.5mlのエッペンチューブで済むような話だと思いますが、後者の場合とどちらがよいものか悩んでいます。検出はCBB染色を行い、バンドを切り出し精製してMSに持ち込みたいです。


もう一つの質問は、Fc融合タンパク質を結合させるビーズにはプロテインGビーズでよいのか、それとも抗ヒト抗体がコンジュゲートされたビーズを用いるのかどちらがいいでしょうか?

マウス胎児ライセート内には胎児の抗体が含まれているとは思うので、プロテインGビーズは敬遠すべきなのかとも思うのですが、胎児IgGはプレクリアをすれば除けるようにも思います。どちらのビーズがいいでしょうか?

大変初歩的な質問だと思いますが、周りに聞ける環境になく、ここで質問させてもらいました。
宜しくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.7365-2 - 2018/11/01 (木) 14:08:31 - asan
どっちでもいいですが、一般的にin solutionでやるものをbatch法、カラムなどに充填させて反応させる方法をフロースルー法などと言います。in solutionの方が時間がかかるのと以外かはわかりませんがflowthoghの方がはるかに結合がよいことが多いですが(おそらく相互作用の確率の問題)、充填してすぐにスピンすると完全に回収で着ないかもしれないです。また、in vitroでのprotein-protein回収をするのは結構難しいので、胎児lysates由来で回収するならタグ付き淡白のtgマウスを作製してやる方が一般的です。

あなたのような方法は一般的にはGST-pulldownという形のやり方で、反応後precisin protease等で切断後溶出する方法があります。

MS解析に持ちこむ場合は、IgGの持ち込みやdetergentの有無など色々注意点もあるので、できれば早めに測定するファシリティーか共同研究者と相談の上その人が良いと思うやり方を踏襲するのがいいと思います。バックグラウンドや結合タンパク質が少ない場合は銀染色せずにon beadsで消化したり直接酸などで溶出後にダイレクトにLCMSをする方法がロスが少ないですが、回収して銀染色をして切り出して消化後解析の方がいいかもしれませんね。mlオーダーで溶出した場合はアセトン沈殿などで濃縮とバッファーの組成を整えてからSDS-pageすればいいです。

コンジュゲートが共有結合でされてるならば熱溶出後にIgG等の持ち込みが減るのでその方がいいですが、SDS-Pageをするならどっちでもいいかもしれないですね。

Fc融合タンパク質でのプルダウン、質量分析について。 削除/引用
No.7365-1 - 2018/11/01 (木) 13:04:48 - Fc
一つ質問させてください。

この度、ヒトIgG2Fcの融合タンパク質を作製しまして、これを用いて相互作用する分子をマウス胎児ライセートからプルダウンし、結合タンパク質を質量分析にて同定したいと考えています。

私はこの手の実験は初めてなもので、プルダウンのニュアンスをどう考えたらよいのか悩んでいます。

例えば50ugほどのFc融合タンパク質をプロテインGビーズ(50ul分ほど)と混和後、そこへライセートを流してプルダウンし、ビーズを洗浄後、SDSサンプルバッファーで溶出を考えていましたが、

ある論文ではガラス製か何かの円柱状のカラムにビーズを充填し、そこへライセートを入れ、洗浄後、溶出バッファーでmlオーダーで溶出するというものでした。

おそらく前者であれば1.5mlのエッペンチューブで済むような話だと思いますが、後者の場合とどちらがよいものか悩んでいます。検出はCBB染色を行い、バンドを切り出し精製してMSに持ち込みたいです。


もう一つの質問は、Fc融合タンパク質を結合させるビーズにはプロテインGビーズでよいのか、それとも抗ヒト抗体がコンジュゲートされたビーズを用いるのかどちらがいいでしょうか?

マウス胎児ライセート内には胎児の抗体が含まれているとは思うので、プロテインGビーズは敬遠すべきなのかとも思うのですが、胎児IgGはプレクリアをすれば除けるようにも思います。どちらのビーズがいいでしょうか?

大変初歩的な質問だと思いますが、周りに聞ける環境になく、ここで質問させてもらいました。
宜しくお願いいたします。

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