BioTechnicalフォーラム [エタノール沈殿について]

エタノール沈殿について

No.7378-TOPIC - 2018/11/05 (月) 14:23:53 - A

大学4回生です。現在、制限酵素処理したベクターとアニーリングしたインサートそれぞれエタノール沈殿を行っています。
2度行いましたが、成功しません。

手順は以下の通りです。
①核酸溶液の1/10の3M酢酸ナトリウムを加えて混ぜる。
②100%エタノールを核酸溶液の2.5倍量加えて混ぜた後、1時間以上ｰ20℃で静置
③4℃15000rpmで50分遠心
④上清を捨て、70%エタノール200µl加える
⑤4℃15000rpmで10分遠心
⑥上清を取り除いて乾燥
⑦MilliQで溶かす

どこかおかしい点があれば、また、コツなどあればご指摘お願いします。
　

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No.7378-9 - 2018/11/06 (火) 01:57:44 - おお

>油断するとふわっと舞い上がることもあるので。

ただちょっと矛盾しますが、実際にペレットが見えないぐらい微量でもハンドリングできるというのも事実ですけど。

(無題)

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No.7378-8 - 2018/11/06 (火) 01:55:56 - おお

成功というのがどういうOutputで判断しているのかわかりませんね。
DNAが直接的に検出できなかったのか（A260で測定するとか電気泳動でみたとか）、なにか活性みたいなもの（Transformationとか）がなかったのか。後者ならDNAがなかったか、違う原因で活性がなかったのか判断をどうするのかというのも考えなければいけません。

まあよくあるのが、沈殿したペレットが見えないか確認しないまま遠心上清と一緒に捨ててしまったということ。そこにベッタとはりついてなくって、油断するとふわっと舞い上がることもあるので。

(無題)

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No.7378-7 - 2018/11/05 (月) 23:36:41 - 中年

"どう"成功していないのですか？収率が悪い（あるいはゼロ）だということでしょうか？

サンプルの濃度はどのくらいですか？

「アニーリングしたインサート」ということは、インサートはオリゴヌクレオチドですか？

(無題)

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No.7378-6 - 2018/11/05 (月) 16:09:33 - AP

>②100%エタノールを核酸溶液の2.5倍量加えて混ぜた後、1時間以上ｰ20℃で静置

フリーザーで冷やすのは黎明期の常識でしたが、後に不必要であるばかりか、かえって回収率を落とすということが明らかになっていて、いまじゃやらないのが常識です。

>③4℃15000rpmで50分遠心
マイクロ遠心チューブ（エッペンチューブ）程度の体積でngオーダー以上のDNAがあるなら、12,000 xg以上あれば10-15分程度で十分。非常に濃度が低いときや対象のDNAが短いときは（100 bp以下とか）の場合は遠心時間を30分以上に伸ばすとか、共沈キャリア（グリコゲンなど）を加えますが、質問の実験ではそんなことないはずですよね。

まあ、失敗したとしたら、上清を除くときにDNA沈殿も吸い出しているのがほとんどだと思います。

(無題)

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No.7378-5 - 2018/11/05 (月) 16:00:58 - KK

グリコーゲンいれましょう。
白い沈殿できて，わかりやすいよ。

(無題)

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No.7378-4 - 2018/11/05 (月) 15:25:13 - 774R

沈殿していないという根拠は？

(無題)

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No.7378-3 - 2018/11/05 (月) 15:01:31 - ?

誰がそんなに時間のかかる下手くそなプロトコールを教えたの？
DNAの量はどのくらい含まれているの？
白いペレットは小さいだろうけど見落としているだけの可能性はない？
共沈剤でも加えてやってみたら。