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(無題) 削除/引用 No.7385-11 - 2018/11/07 (水) 11:41:44 - ウエスタン初心者 AP　様 ご回答ありがとうございます。 まだ実験を始めていないので、頭でっかちになってしまったのかもしれません。 実際に実験を始めたら、必要な部分や省略する部分がわかってくると思います。 w３せdrftgyふ　様 ご回答ありがとうございます。 内部標準のサチュレーションの問題も考慮に入れて実験したいと思います。 BCA　様 ご回答ありがとうございます。 いくつか論文でウエスタンの実験方法を読みましたが、総蛋白質量の測定を行っている論文と測定の記述のない論文がありました。記載を省略しているだけかもしれませんが・・・・。 やはりスタンダードな方法を試そうと思います。 asan 様 ご回答ありがとうございます。 あとで困らないように濃度の測定も併せて行おうと思います。 おお　様 ご回答ありがとうございます。 重量の測定も試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7385-9 - 2018/11/07 (水) 10:50:20 - おお その摘出した臓器の重量はほんとに測れないのかな？１０ミリグラムぐらいのオーダーであればはかれそうなきがするけど。

(無題) 削除/引用 No.7385-8 - 2018/11/07 (水) 10:29:16 - asan >少し前にウエスタンを始めた先輩にいろいろと手順を聞いたのですが、タンパク質濃度を測定していないそうです。 先輩は研究室の先生に指導してもらったそうなのですが、やはりタンパク質濃度は測定していないそうです。 例えば同じ細胞数撒いたのだから同じはずだとかいってやらない人は知ってますが、特に理由もないのにloading controlを取らないというのはあまりスタンダードな方法ではないでしょう。それで揃うなら別にいいかもしれませんがね。 そもそも、何マイクロg流したのか？とか、トータルlysatesが揃ってるか？という情報を客観的に提示できないと困るのは論文に出した時だと思いますよ。条件が同じにしたから同じである、という言い方は正しいように見えて単なる本人の言い分なので、例えばtotal loading量を揃えたならb-actinやGAPDHは見なくてもいいじゃん、と言ってるようなものですよね。だから、タンパク量を揃えたし、実際ハウスキーピング遺伝子の量が揃ってるから条件は一緒だよね？という意味でこのようなやり方が一般的になってるのだと思います。 極論言えば何を基準にするかと言う問題に正解はありませんから、細胞数で添える方がタンパク量よりも正解かもしれませんし、タンパク質”濃度”で揃えるのが正解かもしれません。RNAseqやproteomeなどの研究の場合はトータル量を揃えても、全体の中央値や平均などで標準化して実験誤差を揃えたりするノーマライズは一般的にやられますが、これもそうやった方が意味のある結果になることが多いからです。でも全体の発言量のヒストグラムが変わらないと言う根拠もないじゃんと言う話も当然あるので、プロテオームではハウスキーピング遺伝子だけを集めてそれで規格化するような方法もあります。 直接サンプルバッファー等での回収に比べて、単純に濃度測定やlysis後のステップがめんどくさいから、という理由でやらないならばそれはあまり科学的な理由ではないので納得のいく人は少ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7385-7 - 2018/11/07 (水) 01:48:21 - BCA w３せdrftgyふ さんの >一般に内部標準につかわれる蛋白質はもともと発現量の高いものが多いので、すぐサチュレーション（シグナル強度の頭打ち）してしまい、実際には２~3倍くらい量に差異があっても、見かけ上はシグナル強度は同じくらいにみえたりします に完全に同意。 定量法に誤差があるという意見は確かにそうだけれど、B-actintとかGAPDHとかを内部標準として揃えるよりかはよっぽど信頼できる（というか、7385-5の話、「どうするかというと」以下の部分、書いてる本人は本当に質問者さんのラボがそれ位きちんとやってるって信じてるのかね？）。 さらに個人的な意見を言わせて貰うと、内部標準で揃えているからタンパク定量はしませんなんて言ってるラボのデータなんか疑ってかかった方が良いよ。適当にサンプル流して、ストーリーに沿ったデータが出たときだけポジティブデータが出た、そうでない時はアーチファクトだったと言ってる可能性すらあるから。総タンパク量で差が出やすい動物の組織でタンパク定量もせずに流しているなんて信じられん。 初心者の間はきちんと教科書を勉強して、スタンダードな手法をまず試した方が良い。そうやって経験をつんでいけば、ここは省いても良い、ここは教科書とは違うがこうやった方が良い、などわかってきますから。 （行き着く先が、ウェスタンはどこまでいっても所詮半定量で信頼に値するデータは出ない、という心境に陥る人もいるけれど、それはそれ、きちんとわかった上でそう考える人がいるのは否定しない） わかっていないうちから応用を試すような真似はしない方が良いですよ。どんな業界のどんな仕事にも通じる話です。ウエスタン初心者さんの疑問はもっともです。

(無題) 削除/引用 No.7385-6 - 2018/11/06 (火) 23:12:38 - w３せdrftgyふ 内部標準としている蛋白質がサンプル間で同じという保証はないです。実験者が勝手に『たぶんこれは変わらないだろう』とおもい変な同調圧力で内部標準認定して使ってるだけです。細胞や組織が違えばもちろんですが、同じ細胞／組織でも一方を何かで処理したもので、他方がコントロールの場合とか、発現が影響受ける可能性はあります。一般に内部標準につかわれる蛋白質はもともと発現量の高いものが多いので、すぐサチュレーション（シグナル強度の頭打ち）してしまい、実際には２~3倍くらい量に差異があっても、見かけ上はシグナル強度は同じくらいにみえたりしますので、各レーンは均等な蛋白質量がアプライ出来てると誤認してしまうことがあります。 なので総蛋白質量で統一して泳動することは重要とおもいます。またオーバーローディングすれば上記のように定量性は大きく損なわれますので、試料の蛋白質濃度を知ることは適切な蛋白質量をアプライするうえでも必要です。

(無題) 削除/引用 No.7385-5 - 2018/11/06 (火) 19:25:27 - AP だから結局は内部標準で揃えて、半定量的な比較する話なんでしょ。 そういうときは、タンパク質定量しても内部標準が揃うという保証はないので、定量値は参考として、最終的には内部標準が揃うように乗せる。 どうするかというと、希釈列を作って内部標準の検量線を引くなどして、比較するサンプル間で内部標準が等価になる量を決めて本番に臨むわけ。 そこまでやるつもりなら、定量は不可欠じゃない。 なんちゅうかな、教科書にそこまで縛られなければならないのか？ 世の中にやり方はたくさんあって、教科書だっていろいろあるわけだから、そうは書いていないプロトコールだってたくさんあるはず。 マニュアルに書いていないことをやるのは不安ですか。そのマニュアルがすべてですか。 そういうのを頭でっかちというのだ。

(無題) 削除/引用 No.7385-4 - 2018/11/06 (火) 19:13:14 - ウエスタン初心者 AP様 回答ありがとうございます。 研究室の過去の論文を調べたところ、Lysis buffer (thermoのt-per tissue~)で溶解後、いきなりSDS−PAGEにもっていってます。 そのデータ（intensities）をB-actinで標準化してimage-Jでrelative levelを出しています。（定量化している？） また、使用しているサンプル（組織）もホールで使用しているのですが、必ずしも重量が同じではないと思われます。（小さい組織の為、重量を図るのは困難です） 一応、マウス一匹分の該当組織とはなっていますが… これは投稿する論文に掲載するデータとして使用できるのでしょうか。 夾雑物のお話もありましたが、信頼性に乏しいのであれば、タンパクの抽出はキット等を使ったほうがよろしいのでしょうか？ >[Re:2] APさんは書きました : > 材料の量を揃えておいて、抽出効率のばらつきが大きくないと考えられるときは、抽出物のタンパク質定量をしないことも多い。例えば、いきなりLaemmli bufferでlysisして泳動にかけることもあるけれど、そういうときは定量しない（夾雑物が入っていて定量しにくいし）。 > > もちろん、種々の抽出方法で抽出して定量して結果でサンプル量を揃えて泳動するというのもやり方の一つ。だけど、定量法には誤差や撹乱があるので（不純物の影響など）、100%信頼しないほうがいい。結局内部標準で揃えるのだったら、定量値は参考程度だな。実際、タンパク質定量で総タンパク質量を揃えても、内部標準がバラバラということはよくある（内部標準自体が動いている場合もあるだろうけれど）。

(無題) 削除/引用 No.7385-2 - 2018/11/06 (火) 17:25:02 - AP 材料の量を揃えておいて、抽出効率のばらつきが大きくないと考えられるときは、抽出物のタンパク質定量をしないことも多い。例えば、いきなりLaemmli bufferでlysisして泳動にかけることもあるけれど、そういうときは定量しない（夾雑物が入っていて定量しにくいし）。 もちろん、種々の抽出方法で抽出して定量して結果でサンプル量を揃えて泳動するというのもやり方の一つ。だけど、定量法には誤差や撹乱があるので（不純物の影響など）、100%信頼しないほうがいい。結局内部標準で揃えるのだったら、定量値は参考程度だな。実際、タンパク質定量で総タンパク質量を揃えても、内部標準がバラバラということはよくある（内部標準自体が動いている場合もあるだろうけれど）。

ウエスタンのサンプル調整 削除/引用 No.7385-1 - 2018/11/06 (火) 16:57:46 - ウエスタン初心者 ウエスタンブロットでタンパク質量の比較をすることになりました。 現在、実験に先駆けてプロトコール等情報収集をしている段階です。 サンプルは動物の組織を使用する予定です。 サンプルの調整について質問があります。 ゲルにロードする際にあらかじめ総タンパク濃度を調べて、ウェル当たりのタンパク量や液量を一定にすると掲示板やプロトコルに書いてあります。 少し前にウエスタンを始めた先輩にいろいろと手順を聞いたのですが、タンパク質濃度を測定していないそうです。 先輩は研究室の先生に指導してもらったそうなのですが、やはりタンパク質濃度は測定していないそうです。 総タンパク質濃度を測らないと定量できないと思うのですが・・・ ACTBやGAPDH等の内在性コントロールを用いれば総タンパク濃度を測ることなく定量できるのでしょうか？ わからないことだらけですが教えていただけませんでしょうか。

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