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ありがとうございます 削除/引用 No.7401-18 - 2018/11/18 (日) 12:01:39 - sou > 774様 ありがとうございます。試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7401-17 - 2018/11/14 (水) 10:36:17 - 774 一般的な細胞であれば、4日で影響が出るとは思えません。 10%血清の培地は4℃でもっと長期間保管しませんか？ 気になるようでしたら、次回血清を少し分注して4日後に試してみるとか。 もったいないと思うかもしれませんが、今後の保存条件の検討だと思えば許されるかと。 （プライマリーの特殊な細胞だと影響があっても不思議じゃないですが。）

ありがとうございます 削除/引用 No.7401-16 - 2018/11/14 (水) 05:58:59 - sou 皆様、たくさんのご意見ありがとうございます。とても参考・勉強になりました。 私が不勉強ゆえの厳しいご意見も甘受いたしますし、そのような意見に対するサポート的なものもあって、大変有り難かったです。 ちなみにですが、再凍結せず、4℃で保存して4日後に再度同じ系で培養を行なったら、非常に増えが悪く・・・困りました。血清以外にもテクニカルな問題があるかもしれないという初心者レベルなのでいろいろ振り返りをしているところですが、血清に関しては4℃で保存した場合でもやはり多少は影響が出るでしょうか？比較的近日中に再度使うのでと思い「再凍結」をしなかったわけですが・・・。 私の使っているものが培養環境にsensitiveな細胞なのかもしれませんが、ご意見頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.7401-15 - 2018/11/13 (火) 22:32:19 - おお 凍結すると変性したりというタンパクは個々のレベルでキャラクタライズされているものもあります。 氷の結晶が出来ることによる構造への影響と書いたのですが、それ以外に誘拐するときのｐHや成分の濃度の変化なども悪影響を及ぼす場合もありますね。また小分子でもNADHなどはそういうのにかなりセンシティブで要事調製で溶液を凍結するなとよく言われます。実際知らないで凍結して保存して、２回目に実験がワークしなくなった人もいました。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27224008 https://www.nature.com/articles/srep24866#f3

(無題) 削除/引用 No.7401-14 - 2018/11/13 (火) 22:13:28 - ghjkl FBSの凍結融解３回くらいならいままで普通にやってたけど、それで細胞の具合が悪くなったことはありません。 ８読んで９読んでまた８読むと分からなくなりました。

(無題) 削除/引用 No.7401-13 - 2018/11/13 (火) 16:20:43 - Tako 余談になりますが、とある有名ブランドFBSメーカーからFBSを購入する時、ロットチェックをしてこのロットで購入しますとなったあと、同じロットでheat-inactivateしたもの+$XXでありますよ（できますよ？）というので、お願いしたら、そのロットのものをいったん溶かして、heat-inactivateして、また凍結したボトルを納入してきた。融解再凍結するくらいなら、自分で使用前にしたのにと後悔したことがある。FBSメーカーでも、ダメダメ言っておいて、実は、1回くらいは大丈夫、の精神なのね。凍融解したと分かったのは、heat-inactivateした日付シールが貼ってあって、それが発注日よりあとで、確認したらそうですと。

(無題) 削除/引用 No.7401-12 - 2018/11/13 (火) 16:18:16 - おお 凍結によるタンパクのパフォーマンスの低下が想定されているのでしょうね。水分子は特殊な挙動を凍るときにとるので、特にタンパクは物理的に構造がひずめられる可能性があります。 ただ凍結されていた血清をぶんちゅうして再凍結しておいたりすることもあります。ひどうかすることもあるし、細胞がそういう操作でセンシティブなタンパクに強く依存するばあいなどは影響が大きいのでしょう。 昔からよく使われる古典的でポピュラーな細胞は一度再凍結をしたぐらいではあまり増殖という観点では変わらないことが多いかもしれません。ただし見ている現象がセンシティブなタンパクに依存する場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7401-11 - 2018/11/13 (火) 16:08:19 - gaku > だれもそんなこと言っていないし、質問には答えている。 APさん 読んでいるのであなたが答えているのは存じております。 回答者二人の状態で不特定多数を対象にしているような書き方はよくなかったです。 これまでに辛辣な回答を見る度に常々思っていたことなのでこのような書き方をしてしまいました。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.7401-10 - 2018/11/13 (火) 15:54:05 - み なんのために血清を加えていて、蛋白の性質を考えれば大体想像が及ぶことだと思うけど。 凍結融解を最低限にとどめた方が良いだろうし、complete mediumを作製した後も例え冷蔵保存していると言っても早めに消費した方がよいだろうし、使用前の37度インキュベーションも繰り返さずかつ短時間にとどめた方が良いだろう。

(無題) 削除/引用 No.7401-9 - 2018/11/13 (火) 15:54:04 - AP >言うまでもなく自分で考えたり調べたりも大切ですが、聞いたほうが早いですし そして、誰かに聞いた情報というのは、間違っていることがよくある。 先輩からそう聞いた、あるいは先生から聞いたという話ですら、出処があやふやな情報（当時はよく知らないけど、こういうことじゃないかな、という推論にすぎなかったものが、伝言ゲームのうちに「そうなんだ」ってことになっていたり）、ただの迷信、都市伝説の類だったり、ってことはこれまで山程、経験した。 人に聞くのはいいが、裏をとるまで信じちゃだめ。参考意見の一つ、あるいは誰々さんはこう言ってる、程度に留めておけばいい。

(無題) 削除/引用 No.7401-8 - 2018/11/13 (火) 15:39:46 - AP 質問にある、使い切れなくて再凍結というのは、使うときに解かして残りを再凍結、というのを繰り返すということと読めます。 一回の凍結融解では影響はわずかでも、凍結再融解サイクルを繰り返せば、加速度的に品質は落ちます。あとののこった分ほどサイクルを多く経て、同じロット（それどころか同じボトル）の血清を使っているのにかかわらず、結果が違う、という最悪の実験系になりかえない。 実際、生産元の注意書きなどにも凍結融解サイクルを繰り返すな、という風に書いていると思います。計画的に最初の融解で分注して再凍結、小分けを一本ずつ解かして、基本、使い切るまで冷蔵保存、くらいならごく当たり前の運用だと思います。 ただ、「再凍結をさけたほうがいいのはどうしてか」という質問に対しては、先の回答のような答えになるでしょ。 >初心者ならば覚えるべきことは山ほどあるのに疑問に思ったことを一々時間をかけて調べるべきだといった主張ばかりでは伝統工芸の職人技のようにこの道も小さい分野から消えていくことになります。 だれもそんなこと言っていないし、質問には答えている。

(無題) 削除/引用 No.7401-7 - 2018/11/13 (火) 14:59:34 - Tako みなさん、再凍結はダメだというスタンスだけど、小さいラボ、あるいは小グループに分かれたラボとかは500 mlを使い切るのに時間がかかるから、50 mlに分けて再凍結しているところは多いと思いますよ。 影響があるかないかは個別に確かめないといけないとは思いますが、多くの場合は甚大な影響はないと判断されているということでしょう。 試薬として販売されているリコンビナントタンパク・サイトカインなんかも、TDSには凍融解を避けろと書いてあったりするけど、（アメリカでは）冷蔵で送ってきて到着次第フリーザーに入れろとあったりする。それでいいのかと聞いてみると、実はメーカー側で凍融解3回しても活性に変化がないことを確認しているから大丈夫とのこと。こちらも、使う時は再度融解、希釈・分注してまた冷凍してたりする。 FBSにしてもリコンビナントタンパクにしても、4℃で保管してある時点で捨てるか、凍らせて使い切るか、そのへんは各自の判断だけど、安定性を調べたデータを取っておくと、トラブルがあった時にそのせいにしなくて済むのでそうするのがよいね。

(無題) 削除/引用 No.7401-6 - 2018/11/13 (火) 14:26:55 - gaku 当方も初学者ですが、タンパク質の変性に関しては、タンパク質自体が水素結合や疎水結合という弱い力で構造形成されているため、溶媒の物理的な変化や温度変化過程で容易に構造が壊れるためと理解しております。 個人的には初心者ならば疑問に思ったことはその必要性すら関係なく積極的に聞いて解決する方がいいと考える派です。言うまでもなく自分で考えたり調べたりも大切ですが、聞いたほうが早いですし、全く自分で解決しないというならまだしも自分で解決することも並行して行うのならば「聞く」という手段も含めた方がより多くの知識を得られます。 初心者ならば覚えるべきことは山ほどあるのに疑問に思ったことを一々時間をかけて調べるべきだといった主張ばかりでは伝統工芸の職人技のようにこの道も小さい分野から消えていくことになります。

(無題) 削除/引用 No.7401-5 - 2018/11/13 (火) 13:55:25 - a 理由は既に皆様ご指摘の通りですし、ご存じかと思います。 ただ、そういえばダメということは知っていてもどんな影響があるのかといった具体的な現象は予想はついても見たことないなあと気付かされました。 もったいないので僕にはできませんが、ぜひ試して教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.7401-4 - 2018/11/13 (火) 13:40:34 - AP FBSに限らず、タンパク質を始め有機物、高分子なんかは凍結融解はだめというのは教科書的なことなので、この問題を特別扱った文献というのは思いつかないなあ。

(無題) 削除/引用 No.7401-3 - 2018/11/13 (火) 12:57:18 - タンパク質 生化学勉強しなおした方がええで

(無題) 削除/引用 No.7401-2 - 2018/11/13 (火) 12:15:28 - AP 当然ながら、成分の分解、変性が予想されますけれど。 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/p12203.pdf 個々の実験、細胞種でどれほどの影響があるかは自分で確かめるしかないでしよう。 そんなことに労力や時間をかけたり、失敗して回り道するのは無駄だと思うから、みんな製造元の指示を守って適正に保存するんです。

ウシ血清の凍結融解 削除/引用 No.7401-1 - 2018/11/13 (火) 11:49:29 - sou 実験初心者です。 培地に加えるウシ血清（FBS/FCS）について教えて下さい。 解凍後、一度で使い切れずに再保存する場合、再凍結は避けるべきとどの本にも書いてありますが、具体的には何がどう悪影響なのでしょうか？ 凍結融解を繰り返すことによって、培地における血清の働きの何がどう悪くなるのか、教えていただけると助かります。 もし文献的な情報もあれば併せてご教示お願いします。

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