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>おお様 削除/引用 No.7419-8 - 2018/11/21 (水) 08:46:08 - nak ありがとうございます。 一度、中年さまに提案いただいた方法と合わせていくつかの条件で細胞からタンパクを溶出してみて比較してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7419-7 - 2018/11/20 (火) 12:14:49 - おお >まさにそのロシュのタブレットを10mLに1つ用いています。 では通常の１タブレット/５０mLでそのバンドは増えますか？

>中年さま 削除/引用 No.7419-6 - 2018/11/20 (火) 10:58:07 - nak ありがとうございます。 なるほど、これは一案ですね。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.7419-5 - 2018/11/20 (火) 10:52:42 - 中年 TCAで固定してしまうのは？ http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%208.html http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%209.html

>おお様 削除/引用 No.7419-4 - 2018/11/20 (火) 10:49:33 - nak ありがとうございます。 まさにそのロシュのタブレットを10mLに1つ用いています。 スプライシングアイソフォームの可能性については、複数出ているバンドの1つはその可能性があると思われますが、最も強いバンドは明らかにそれよりも小さい質量の部分に現れます。 本来50kDa付近に出るはずで、一番小さいスプライシングアイソフォームでも約30kDaなのですが、一番強いバンドは10kDa付近に現れます。 糖鎖修飾などの翻訳後修飾の可能性もありうるのではありますけど、しかし、だとすればそれを証明するのはどうしたら良いでしょうか。結局蛍光色素付きの抗体を用意して二次元電気泳動にかけて質量分析、という方法しかないものでしょうか。 なお、ノックダウンの実験は、そういうバンドが得られるような細胞種に心当たりがないので難しいかなと思っています。ダメでもともと、というスタイルでHL-60とかの好中球もどきでやってみても良いのかもしれませんが…。

(無題) 削除/引用 No.7419-3 - 2018/11/20 (火) 10:46:17 - おお その他だと糖鎖修飾の有無とか

(無題) 削除/引用 No.7419-2 - 2018/11/20 (火) 10:41:31 - おお >proteinase inhibitor cocktail Rocheのやつはプロテアーゼ活性の強いサンプルには１０mlに１タブレットを推奨しているようです。プロテアーゼ阻害剤を増やすことでそのバンドが減るなら分解産物を示唆するデーターになるのではないでしょうか。 もし弱くても同じようなパターンでバンドが検出されるようなCell lineがあればKDして見てもいいかもしれません。 スプライシングアイソフォームの可能性は否定できますか？

ウエスタンで予想外の位置に出たバンドの同定 削除/引用 No.7419-1 - 2018/11/20 (火) 10:21:38 - nak ヒト好中球表面の受容体タンパク（1回膜貫通型）のウエスタンブロットで困っています。 その受容体がある群でover expressionされていることをタンパクレベルで証明したいのですが、好中球溶出タンパクを電気泳動して、市販の抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところバンドの強さは期待通りの差が出たのですが、バンドの位置が予想される位置よりはるか小さい位置に、しかも複数認められました。 おそらくは細胞分離から蛋白抽出過程にかけて好中球に含まれるproteinaseによって切断されたものを見ているのではないかと思うのですが、これが目的タンパク（の断片）であるということを証明するために、次にどういう実験をすればよいかを悩んでいます。 今のところとりあえずは以下の実験を検討しています。 ・1次抗体抜きの条件で非特異的結合でないことを見る ・抗体の免疫源のペプチドを用いて阻害実験を行う ・電気泳動前の検体の処理条件を変えてみる（ボイルしないなど） ・この抗原を強発現している別の細胞種および発現していない細胞種をコントロールとして行う ただ、いずれも直接的に非特異的結合や抗体の交差反応の可能性を完全には棄却できないと思われ、他に良い方法は無いものかと悩んでいます。 あるいはそもそももっと確実にproteinaseを阻害する方法はありませんでしょうか？ お知恵をお貸しいただきたいと思い、投稿させていただきました。 好中球は健常人からフィコール−デキストラン法で分離しました。 蛋白の溶出は0.5% Tritonで、proteinase inhibitor cocktailを添加して行いました。 抗体はウサギポリクローナルで、受容体の細胞外部位にエピトープを有します。BLASTで見る限り、このタンパクに特異的なアミノ酸配列であるようです。 他にも必要な条件があったらご指定いただけますと可能な範囲で記載させていただきます。どうかよろしくお願い申し上げます。

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