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(無題) 削除/引用 No.7420-11 - 2018/11/28 (水) 07:43:07 - エンドー Karasさん、monさん、 ありがとうございます！ やはりHAにしてみます。ありがとうございます。 Karasさん、抗体のクローン名まで教えて頂き、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7420-10 - 2018/11/28 (水) 05:50:33 - Karas 挙げておられるタグですがウエスタンでは経験が無いのですが、 ラット脳IHCでは全て試しました。 ご参考までにその際の膜タンパク質検出力は 3x HA > 3x FLAG = 3x myc >> 3x V5 > 3xAU1 です。 使った抗体は mouse anti-HA (1:1,000; Covance; MMS-101R) mouse anti–c-Myc (1:1,000; MBL; M192-3S) mouse anti–FLAG M2 (1:1,000; Sigma-Aldrich; F1804) もしくは富士フィルム和光anti-DYKDDDDK 1E6 1:1000 になります。 HAとFLAGの抗体がクロスしてしまうという経験は今のところありません。

(無題) 削除/引用 No.7420-9 - 2018/11/21 (水) 10:01:12 - mon どこかで抗myc抗体の9E10って親和性がさほど高くないと読んだような。 ただHybridomaが入手可能なので安価に調製できるのは魅力。

(無題) 削除/引用 No.7420-8 - 2018/11/21 (水) 02:53:38 - エンドー saiさん、おおさん、ありがとうございます！ HAにすることにします！ saiさんの表ではmycよりいいみたいですし、リジンもないですし！ ただ過去の書き込みで気になることが。 Flag抗体がHAを認識しているようだ、との過去トピがありました。 私はHAとFlagの共発現も予定しているので、どうなのか気になる書き込みでした。 抗体のクローンによるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7420-7 - 2018/11/21 (水) 02:24:19 - おお ３つ並べると１０倍とか検出感度があがるとか３xFLAGの説明で見たことがあります。ほかはよくわかりませんが感度が結構良くなっているという感触はあります。 IPではC-mycはMyc tag エピトープ部位が立体的に抗体がアクセスしにくいという話はあるようですが、それでも気になるならそれはさけてもいいのかもしれません。 HAやFLAGはよく使い検出感度で困ることは殆どないです。その他はそんなによく使うわけではないので悪くはないんでしょうけどよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.7420-6 - 2018/11/20 (火) 16:23:16 - sai 感度を上げるために、タグをタンデムに繋げることも1つの手だと思いますが、 抗原とタグの親和性が良いものを選ぶことも重要だと思います。 例えば http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/PA_tag/pdf/PA_TARGET.pdf では、FLAG/M2よりもmyc/9E10の方が良いですが、 PA/NZ-1の方がそれらよりも良いです。 他にも https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27271343 など親和性の良いタグと抗体が報告されていますので、 自分の目的に合致するものを選んで下さい。

(無題) 削除/引用 No.7420-5 - 2018/11/20 (火) 15:54:56 - エンドー おお様、ありがとうございます！ 9E10はマウスのエンドのmycには反応しないんですか・・・初めて知りました。 今のところ、感度を著しく上げる目的 (IFやwesternにおいて)で以下のタグを考えています。 3x myc 3x FLAG 3x V5 3x HA 3x StrepTagII などでしょうか。 C末側に付けたいです。感度をかなりあげないとエンドのものは見えないと考えています。 おお先生ならどれを選択されますか？ 導入したい細胞はヒトのセルライン(293やSaos2)です。

(無題) 削除/引用 No.7420-4 - 2018/11/20 (火) 15:45:27 - おお マウスなら９E10などのモノクロは内在性のMycを認識しないので問題ないです。 ヒトのエンドのMycは理論上認識しますけど、問題になったっていう話しはきかないですね。免疫染色でも使ったりしてるのもみますけど。 https://www.labome.com/method/Myc-Antibody-Review.html

(無題) 削除/引用 No.7420-3 - 2018/11/20 (火) 15:33:41 - エンドー PYK様、早速ありがとうございます。 本当に嬉しいです。 HAは考えたこともこれまでに使用したこともありませんでした。 mycよりかは、HAの外来抗原の方が良さそうですね！ 9アミノ酸ですので、それほど長くありませんし。 にしても特徴的なアミノ酸配列ですね。 ちなみにPYK様はCRISPR/Cas9を使ってどのように導入されたのでしょうか？ HDRでノックインでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7420-2 - 2018/11/20 (火) 15:28:38 - PYK 3xHAはどうでしょうか？ 以前にCRISPR/Cas9で目的の遺伝子のN末に3XHAを導入し、綺麗にIFで観察できました。

エンドのタンパク質にタグをつける場合、mycかFLAGか 削除/引用 No.7420-1 - 2018/11/20 (火) 14:27:35 - エンドー いつも拝見させてもらっています。 今、興味ある遺伝子の局在（核）に興味があります。 このタンパク質はエンドのレベルが非常に低く、ウエスタンでも免疫染色でも見ることができません。 発現ベクターを作り、強制発現でもって漸く抗体染色が出来ます。 つまり、そのタンパク質に対する抗体はモノが多ければワークするだろうと考えています。 ただ、強制発現ではなく、どうにか内在性のタンパク質の局在をみたいです。 そこでCRISPR-Cas9を利用して、タンパク質のC末にタグを付加したいです。 感度を上げるため、同じタグを3つ繋げようと思っています。 私はよく実験で、3x mycを使います。 ただ、mycだと内在性のmycもあるかと思います。ただこれまでmycをタグに使い強制発現実験で問題になったことは記憶にはありませんが・・ ただやはりmycよりかは3x FLAGや3x V5などの方がいいでしょうか？ EGFPなどもあるかと思いますが、感度を高めるため、あとCRISPRで挿入しやすいようにできるだけ小さなタグで考えています。 長くなりましたが、質問は検出限界以下のエンドのタンパク質にタグを付加する場合、3x mycよりかは別のトリプルタグの方がいいでしょうか？ ちなみに強制発現させていない細胞をmyc抗体で染めても、エンドのmycは染まった経験はありません。

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