monさん
No.7466-4 - 2018/12/13 (木) 13:58:50 - mon
DNAバーコードについては
www.riken.jp/pr/press/2017/20171019_2/
を参照してください。
＞gRNAの配列決定にはぐるさんの仰るように次世代シークエンサー(この場合、全ゲノムシークエンスと置き換えても良いでしょう）は必ずしも必要ではありません。
なるほど、そういう理解で良かったのですね！
すっきりしました。次世代シークエンサーはうちの施設にもあるようですが、それが使えないようではゲノムワイドスクリーニング (GWS)はできないのかなと思っていましたので、サンガー法でも行けるようなら自分の実験にも使って行けるかもですね！
＞ただし、（ゲノム配列が決定されていない生物や癌細胞など元々変異が多数ある細胞などの）gRNAの標的遺伝子探し、およびゲノム編集された部位を同定するには、全ゲノムシークエンスの方が早いです。
全ゲノムシークエンスすれば、ゲノム編集された部位だけで無く導入されたgRNA遺伝子配列ごと同定できます。
なるほど、そういう理解なのですね！
CRISPRiなどのGWSではgRNAの標的となる遺伝子は（オフターゲットは予測できないでしょうが）わかっているので、全ゲノムシークエンスは必須ではないということはわかりました。
＞レトロウィルスを利用した場合、gRNAの標的ではなく、ゲノムに挿入されたレトロウィルス配列自体が目的の表現型（遺伝子破壊・遺伝子発現の変化）を引き起こしている可能性もあります。
そのためレトロウィルスの挿入部位(遺伝子等）同定も注意事項になります。これも全ゲノムシークエンスで同時に同定可能です。
なるほど、確かにそうですね。
ゲノムの大部分がイントロンだとしても、挿入部位によっては遺伝子やマイクロRNAを破壊してしまうかもしれませんもんね。そういう場合はウイルスベクター上に設計したプライマーではどこに挿入されているかの情報は得られませんもんね。もちろん、insertional mutagenesis法で用いる方法を適用すれば、どこに挿入されたかはわかるかとは思いますが、手間ですもんね。そういう場合には全ゲノムシークエンスの方が良さそうですね。ありがとうございます！！
NGSさん
＞ぐるさんがお読みになっている論文がどのようなものかわかりませんが、表現型がクリアでかつpositive screening、理想的にはシングルクローンが簡単に同定できるような実験であれば、もちろん得られたcloneそれぞれに対してgRNA部分の配列のみを決定すれば良いのはおっしゃるとおりです。
ありがとうございます！
今読んでるのは受容体を同定するという論文です。CRISPRiでリガンドと結合しなくなる集団からgRNA標的遺伝子を同定し、受容体を同定しています。表現型がクリアなので、NGSでなくても良さそうですね！
＞でも、それほどクリアな表現型でなくて、KOプールからpositiveなクローンが濃縮されるというような場合には、バルクでgRNA部分、もしくはより理想的にはクローン間の増幅効率に大きな差異がないバーコード配列を大量に読むことが必要になります。さらに深刻なのは、negative screening、すなわちKOされたら死ぬ、もしくは生育が悪くなるような遺伝子をスクリーニングする場合です。この場合にはおっしゃるような方法は使えませんから、バーコードを大量に読んで、プールから脱落、もしくは減少しているものを探すしかないことになります。
すごく理解できました！！
ありがとうございました！！ |
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