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(無題) 削除/引用 No.7488-7 - 2018/12/19 (水) 21:08:20 - asan 普通はlipofectionでコトランスフェクションする場合はほとんどの場合片方のみ入るなんてことはありえない状況になります。というのは、リポフェクションは尋常でない量のDNAをどかっと入れるので、細胞にどちらか一方のみが選択的に入るなんてのは確率的に非常に稀なことになるからです。 この原理を利用して耐性マーカーの乗ったベクターをコトランスフェクションをすることで安定発現株をセレクションすることは昔からよく行われています。ただ、より確実性を保つためと、強い発現クローンを取るためにセレクションで用いるベクターの量を1:5や1:10ぐらいの少なさにすることが一般的ですね。 もちろん、promoterの強さとか淡白自体の安定性の違いによってタンパク量自体のブレはあると思いますが、原理的にDNA量で1:10だろうが1:100だろうがどちらか一方のみがliposomeに含まれて取り込まれるなんてことは普通は起きないということです。細胞内にDNAはすこしばかし入ったからといって十分に転写されるかどうかは少し別の話ではあります。

(無題) 削除/引用 No.7488-6 - 2018/12/17 (月) 15:23:32 - a なるほど、情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7488-5 - 2018/12/17 (月) 10:55:33 - おお 入っているというのをどう評価するかというのはありますが、 発現に偏りがある細胞も結構見られるとききます。原因は入っているプラスミドの比がまちまちなのか、プロモーターの競合なのかはなんとも結論を得づらいかもしれません。また導入した遺伝子産物が細胞の生理状態で大きく安定性が変われば培養中の特定の生理状態にある細胞の集団だけ偏ったように見える可能性もありますし。効果的に発現するのに必要なプラスミド数の閾値も存在するかもしれませんし。 https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0027321 https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/xtg-cotransfect-pdna.html

(無題) 削除/引用 No.7488-4 - 2018/12/17 (月) 10:37:35 - み >[Re:3] aさんは書きました : > つまり入り方としては後者型 (入る細胞集団は大体皆AB両方入っているし、入っていない集団はどちらも入っていない) であると暗に示している、ということでいいのでしょうか？ 違うと思うけど。 耐性遺伝子アリのBが入っていれば必ずAも入っているという状況をつくりたいからBの量を少なめに入れたりするわけでしょう。 極端に考えてAを１ng、Bを１００ngの量でダブルトランスフェクトしたら圧倒的にBのみが入った細胞が獲得できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7488-3 - 2018/12/17 (月) 10:22:13 - a つまり入り方としては後者型 (入る細胞集団は大体皆AB両方入っているし、入っていない集団はどちらも入っていない) であると暗に示している、ということでいいのでしょうか？ 明らかにそのことを示しているデータもしくは、実際に検証してみた経験をお持ちの方はいらっしゃいますかね？

(無題) 削除/引用 No.7488-2 - 2018/12/17 (月) 06:38:30 - おお >後者モデルであれば、例えばベクターAを発現する細胞をセレクションしたいが、ベクターAには適切な選択用遺伝子が乗っていない場合に、追加で選択用のベクターBを入れて、Bの発現を利用して、Aを発現する細胞を選択することができるのかと思うのですが、どうなのでしょう。 これは手法として存在していて、お示しの例の場合Bのプラスミドを全体のTransfectionのDNA量の１０％以下にすることがおおいです。

二種類のプラスミドベクターをトランスフェクション 削除/引用 No.7488-1 - 2018/12/17 (月) 06:09:48 - a 二種類以上のプラスミドベクターを混合し、一つの哺乳類細胞のカルチャーにトランスフェクションした場合、どのような割合で、両方のベクターが発現している細胞を得られるのでしょうか？ 例えばpositive rate が50 %になるトランスフェクション法があったとして、これを用いて2種ベクターの混合物をトランスフェクションすると仮定します。 それぞれがランダムに、カルチャー中の50 %の細胞に入って発現する、というモデルだと、double positiveな細胞の割合はかなり低いはずです。 一方で、例えばトランスフェクション率50 %になるというのは、当該の処理でプラスミドベクターを取り込んで発現できる状態にある細胞が全体の50 %含まれるということであって、それらreadyな細胞集団は両方のプラスミドベクターを取り込んで発現する、というモデルで考えると、double positiveの割合も大体50 %になると期待できます。 後者モデルであれば、例えばベクターAを発現する細胞をセレクションしたいが、ベクターAには適切な選択用遺伝子が乗っていない場合に、追加で選択用のベクターBを入れて、Bの発現を利用して、Aを発現する細胞を選択することができるのかと思うのですが、どうなのでしょう。

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