この度はお世話になります。研究を始めて日が浅い大学院生です。長文で分かりにくい点もあると思いますが、宜しくお願い致します。
iNOSの蛍光免疫組織染色に関する質問です。
ポジコンとして、マクロファージCell lineのRAW 264.7の細胞染色では、LPS 1μg/mLで刺激し1時間後、iNOSの蛍光免疫染色とウエスタンの両方ではっきりとiNOSの発現が確認できているのですが、組織を用いた解析ではiNOSの発現が確認できませんでした。
組織は、筋ジストロフィーモデルマウス(mdx)や、BaCl2を筋肉内注射したB6マウスの前脛骨筋、またポジコンとしてLPSをB6マウスの腹腔内に注射して1時間後に採取した肝臓の凍結切片を用いています。
どのサンプルでもマクロファージの浸潤とF4/80の発現は認められるのですが、iNOSの発現が認められませんでした。（またmdxでは、筋線維内にもiNOSの発現があるという報告がありますが、こちらも認められませんでした）
組織は凍結切片で4%PFA固定とアセトン固定の両方を試し、膜透過処理は0.1%のTween-20や、0.1〜0.25%のTriton-Xで1時間行いました。
抗体はabcamのab3523とmerckの482728を200倍希釈で用い、どちらもRAW 264.7では免疫染色・WBともにworkすることが確認できています。2次抗体はAlexa488を1000倍希釈で使用しています。
過去の論文を見ると、免疫組織染色もWBも、多くの文献で組織を用いた解析が行われていますが、methodを見て同じ方法を用いても確認できず、同じ研究室内で尋ねてみても解決できませんでしたので、ご質問させていただきました。
アドバイスをいただけますと幸いです。宜しくお願い致します。 |
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