BioTechnicalフォーラム [プライマー]

プライマー

No.7512-TOPIC - 2018/12/24 (月) 23:21:21 - ひろしくん

とある遺伝子をCRISPRでノックアウトしています。ノックアウトの原理としてはご存じのようにgRNA付近にindelが起こり、stopコドンが導入されるというものです。
作成したcell lineをウエスタン、qPCRで蛋白、mRNAレベルでの発現していないことを確認し、次にゲノムレベルでどこにどのようなindelが起きているかを検討するために、Sangerをやっています。作成したノックアウト細胞株は2つで、一つはgRNAをデザインした付近にindelが導入されていましたが、もう一つはPCR増幅ができません。
原因として考えられるのはgRNA部位で切断され逆位が生じたりしていることが考えられます。
こういった場合、どのようにシークエンスを確認するのがよいのでしょうか？
基本的な質問ですが、どなたかお知恵を拝借したいです。

参考情報：
ノックアウトに使うgRNAはGeckov2の情報から、とある遺伝子のエクソン8(112bp)に1箇所、エクソン9(119bp)に2箇所デザインしているため、PCRのプライマーはそれぞれエクソン8、9を挟む形でイントロン内にFW, RVをデザインしています。PCR product sizeはいずれも300bp程度としており、いずれもPCR増幅できません。ちなみにエクソン8-9間のイントロンの長さは3200bp程度です。
　

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No.7512-6 - 2019/01/14 (月) 18:40:20 - いけ

＞とある遺伝子のエクソン8(112bp)に1箇所、エクソン9(119bp)に2箇所デザインしている

とのことですが、その3個のsgRNAを同時に使用したわけではないですよね。2つのsgRNAを同時に使用し、その間の配列を欠失させる方法は頻用されますが、3つ同時というのはOFF-targetのリスクが高いです。nickaseを使用しているのでしょうか。しかし、small indelによる終止コドンの導入の話をされていますので、やはりsgRNAを1個ずつ使用して、通常のcas9タンパクを用いて二本鎖切断を導入しているのだと想像します。

＞ PCR product sizeはいずれも300bp程度としており、いずれもPCR増幅できません。
ということは、得られたsingle cloneは、exon 8あるいはexon 9をtargetとした1個のsgRNAを用いて得られたものであるにも関わらず、exon 8/exon 9の両方ともPCRで増幅してこなかったということになり、それなりの大きい領域の欠損が想定されます。

sgRNAで切断された後のnon-homologous end joiningでは、数塩基のindelが多いですが、それなりに大きな領域の欠損が生じることもありますし、他の染色体との組換え反応が生じることもあります。配列が決定できていないcloneは、目的外の遺伝子のどのような影響が生じているのか保証できませんので、使用しないべきでしょう。また、inverse PCRを試みても、欠損した塩基配列を増幅させることはできません。

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No.7512-5 - 2018/12/25 (火) 05:08:45 - おお

>8-9間のイントロンの長さは3200bp程度です。

長さだけで見るとまるごとPCR可能ではありますね。

プライマーをいろいろな場所に設定して手探りでというのも手でしょうけど、inverse PCRは確かにいいかもしれません。複数のやり方があるでしょうけど、

ゲノムを適切な制限酵素で切断して、セルフライゲーションがドミナントになるようなDNA濃度でLigationすると環状DNAが得られるので、それをテンプレートにしてinverse PCRするのが一番シンプルでしょう。

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No.7512-4 - 2018/12/25 (火) 03:16:57 - tomo

それはもちろん可能です。
そのようにinsertional mutagenesisでの遺伝子同定はなされて来ていますから。

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No.7512-3 - 2018/12/24 (月) 23:54:37 - ひろしくん

プラスミドDNAでなくてもinverse PCRは可能なんでしょうか？

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No.7512-2 - 2018/12/24 (月) 23:38:41 - tomo

inverse PCRでやるかなぁ。