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(無題) 削除/引用 No.7560-9 - 2019/01/13 (日) 03:19:24 - muta おおさん、ありがとうございます！ 私が勘違いしていたようです。 おおさんからの書き込みを見て、Mutagenesis直後（大腸菌に形質転換する前）は、親プラスミドの持つ超高次構造は取らないですよね...ここを勘違いしていたので、このトピックを立ててしまいました。 なるほど、しっかり理解できました。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.7560-8 - 2019/01/13 (日) 03:17:20 - muta MPさん、みさん、ありがとうございます！ やはり鋳型を低く抑えるのがポイントのようですね。 私はこれまで50ngを鋳型に用いていましたので、プロトコル通りではありましたが、バカでした。 実はコロニーできていました！！ 早速ミニカルチャーしまして、月曜にシークエンスオーダーします！ ありがとうございます。 今回は1ngと5ngでしたが、1ngでもコロニーできていました。ただどちらも同数くらいのコロニー数でしたが...。

(無題) 削除/引用 No.7560-7 - 2019/01/12 (土) 12:13:42 - み 鋳型の量が多すぎるからwildばかり取れるのだと思う。 Takara PrimeSTAR mutagenesis basal kit これを使ってプロトコール通りやれば6個コロニー拾えば大抵全て当り。 50ulのPCR反応ボリュームで100pgしか鋳型が入れない。 自分はPCRの反応ボリュームを半分でやっていて問題ない。 PCRしたあと泳動チェックなんてやらずに直接1ulを10ulのコンピテント細胞に形質転換すれば数十個コロニーが出る。 MPさんがPrimeSTAR mutagenesis Maxで問題ないと仰っていることと意見は同じです。自分はMaxとやらは使用経験ないけど。。。

(無題) 削除/引用 No.7560-6 - 2019/01/12 (土) 11:01:45 - MP 鋳型の量が少ないので、dpni処理は不要です。もちろんpcr産物がきちんとあるのが大前提です(ゲルで流してうっすら見える程度でもokでした)。ただ鋳型の混入は完全には避けられないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.7560-5 - 2019/01/12 (土) 09:35:53 - おお >おおさんの考えでは、インプットである親プラスミドと同じバンドパターンとして出現するはず、という理解でしょうか？ 電気泳動する目的はなんですか？ PCRで得られたDNAのサイズが（その分解能のレベルで）あっているか確認することですよね。 でサイズがあっているかはサイズマーカーとの比較すれば大体わかります。ただしたとえば3.1と3.3kbpを判断するのはマーカーからでは難しい。つまり期待するバンドが3.1kbpで実際得られたバンドが3.3kbpでも、期待するバンドが取れなかったと確信するに至らないということ。 じゃあどうするんですか？ テンプレートのプラスミドとサイズがほぼ一緒ならい、テンプレートのプラスミドと比較したらいいでしょうけどもともとプラスミドは環状で直鎖のPCRフラグメントとは比較ができないでしょ。プラスミドを１箇所制限酵素できって直鎖にすればそれを目安に同じ長さか判断できるという話。ただし、制限酵素のバッファー塩濃度等によって移動度が変わるのでそのへんは注意が必要。 ただし、Mutagenesis のStrategy によってはサイズの比較が容易じゃないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7560-4 - 2019/01/12 (土) 09:05:48 - muta おおさん、 なんとーーーー。。。やはりノンスペですかねぇ...もう少ししたら大腸菌プレートにプレートするのですが、翌朝コロニーは生えて来ないかもしれませんね。。 おおさんの考えでは、インプットである親プラスミドと同じバンドパターンとして出現するはず、という理解でしょうか？ MPさん、 PrimeSTAR MAXは使用経験はありません。 pgでもいけるのですね。すごい。けどDpn1処理を必要としない理由がわかりません、、、。

(無題) 削除/引用 No.7560-3 - 2019/01/12 (土) 08:40:22 - MP 最近、TakaraのPrimeSTAR MAXを使ったmutagenesisを多用してますが、鋳型はpg orderで済みますし、PCR産物をそのままtransformするだけなので楽ですよ。今のところうまくいかなかったことはないです。

(無題) 削除/引用 No.7560-2 - 2019/01/12 (土) 07:06:20 - おお ノンスペじゃないですか？

site-directed mutagenesisがうまくいきません。 削除/引用 No.7560-1 - 2019/01/12 (土) 06:34:14 - muta いつも拝見しています。 今、2塩基置換を行いたく、site-directed mutagenesisを試みています。 何度かこれまでにしたことがありまして、手技等、問題ないはずなのですが、今回は8つコロニーをピックしても全て親でした。 最初の鋳型はアジレントテクノロジーのプロトコルに従い、50ngの親プラスミドを用いました。 ただうまくいかず、これまでのここのフォーラムを拝見したところ、1ngでも行ってる方の書き込みがありましたので、気持ちサイクル数を増やして、1ngと5ngでsite-directed mutagenesisを行い、これまで行って来なかった電気泳動も行ってみました。 すると、1ngと5ngの鋳型を用いたいずれもバンドが目に見えて増幅しており、大変驚いています。 これに関連して2つほど質問させてください。 1.　この”増幅”されたものは100％変異を持っていると考えて差し支えないという理解で正しいでしょうか？ 2.　親プラスミドも電気泳動時に流しました。するとバンドのパターンが親では3つのプラスミドの超高次構造に由来するバンドが確認されますが（3つのうち、一番下のバンドが最も太かったです）、site-directed mutagenesisのサンプル（Dpn1処理前です）はそのどのバンドにも一致せず、たった一本（あとはプライマーダイマーっぽいものがあります）でした。 このことはメチル化の有無だったりと必ずしも同じバンドにはならなくてもいいのかもしれませんが、どう思われますでしょうか？コメントをいただけますと幸甚です。

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