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(無題) 削除/引用 No.758-6 - 2012/07/17 (火) 13:34:22 - Q ぶっちゃけ話です。 ムラがあったメンブレンということを知ってしまっている我々では 再利用して「定量性の観点から」という結果を求めるためにどうすればいいか？ という質問について、 泳動からやり直した方がいい これしか言いたくありません。 さらにぶっちゃけですが、 量が限られているサンプルなのに、 メンブレンの幅に合っていない容器を使ったとか、 抗体をケチったとか、その緊張感のなさをまず改善した方がいいと思いました。

(無題) 削除/引用 No.758-5 - 2012/07/15 (日) 21:50:13 - Harmonia ぼくならあきらめます。 発表できるデータにできる自信がもてないからです。 質問者さんの観点は「定量性」で、ムラになった原因は「抗体が均一に結合していなかった可能性が高い」と推測されています。 そうであれば、どのやり方であっても、スタートの材料の状態が均一ではない、とぼくは考えました。 だからこそ、質問者さんは「抗体がくっついたムラは無視していいよ」という助言がほしかったので、ここで質問されたと思いますが、ぼくならあきらめます。 どなたか、良い知恵が有るかと思いますが、ぼくなりに「質問者さんの懸念」の延長線上の問題を書きますと、 １、２とも新しい1次抗体がくっつくのは、前の1次抗体がくっつかなかった場所で、新しい2次抗体がくっつくのは新しい1次抗体のところ。つまり、次回のシグナルは、前回のシグナルムラの逆のパターン。 ３は、ストリッピングに影響する抗原のはがれで、抗原に抗体がくっついているものとくっついていないもので、抗原のはがれに差がないかどうかは、知らない。

(無題) 削除/引用 No.758-4 - 2012/07/15 (日) 12:33:40 - SEM aaaaさん、THさん、 早速の御意見ありがとうございました。 やはり、3つの方法の中だとストリッピングが無難なのですね。 厳密はお二方がおっしゃるように、泳動しなおすのが一番だとは私も思うのですが、サンプル量が限られているため、なんとか再利用できればと思っておりました。いずれにせよ、どこかのタイミングで泳動からはやり直そうとは思っていますが、ストリッピング自体初めての経験なので、やるだけやってみたいとは思っています。 ムラの原因の件ですが、メンブレンの横幅が容器に十分に収まりきってなかったことと、抗体量をケチったことで、抗体溶液にメンブレン全体が十分に浸っておらず、抗体が均一に結合していなかった可能性が高いです。

(無題) 削除/引用 No.758-3 - 2012/07/15 (日) 11:08:11 - TH 私もaaaaさんに賛成です。ストリッピングしてブロッキング→一次抗体反応と進めるか、サンプルが余分にあるなら泳動からやり直します。

(無題) 削除/引用 No.758-2 - 2012/07/15 (日) 03:40:17 - aaaa ムラの原因次第で対応が変わると思います。 Wash不足の場合は、もう少しWashをしてから再検出します。 抗体の濃度が高すぎた場合は、ストリッピングします。 原因が記載されていませんが、とりあえず私ならストリッピングします。 なおかつ、同時に泳動からやり直します。

ウェスタンブロッティングの再検出（メンブレン再利用） 削除/引用 No.758-1 - 2012/07/15 (日) 02:45:40 - SEM ウェスタンブロットの検出結果において、ムラが出てしまい、同じメンブレン・同じ抗体を使用して1次抗体の抗体反応からやり直し、再検出をしたいと考えております。 （ムラが出てしまった原因については、究明済みです。） その適切なやり方につきまして、皆様のお知恵をお貸しいただきたく、書き込みさせていただいております。 現在のところ、下記の3つのやり方をいずれかを考えているのですが、定量性の観点から、どのやり方が最適か、ご助言いただければ幸いに存じます。 （各項目の下には、私にとっての懸念材料を参考までに記載させていただきました。） また、そもそも下記以外に適切なやり方があれば、ご教示いただければ幸いです。 1. そのままの状態で1次抗体の抗体反応からやり直す 　⇒ 最初の抗体反応時に標的タンパクにくっついた1次抗体には、 　　 すでに2次抗体が結合しており、なおかつその2次抗体上の 　　 HRPは失活しているはずです。この状態で1次抗体反応をやり直すと、 　　 新たに1次抗体が結合できる標的タンパクが少なくなり、 シグナルの減弱や定量性の欠如が起こるのではないかと 懸念しています。 2. メンブレン上のHRPを一度不活化させたのち、 　 1次抗体の抗体反応からやり直す 　⇒ 1.と本質的にはあまり変わりません。 　　 1.では、「2次抗体上のHRPは失活しているはず」と申し上げましたが、 それでもすべてのHRPが均一に失活している保証はないので、 念のため過酸化水素水でHRPを一度不活化させたのちに、 1次抗体の抗体反応からやり直す、というこの手法も一応挙げさせて 　　 いただきました。この手法で私が懸念する問題点については、 　　 1.と共通です。 3. 抗体を一度ストリッピングしたのち、1次抗体の抗体反応からやり直す 　⇒ 別のタンパクを同一メンブレンを用いて検出する、 というケースにおいてよく用いられる手法かと存じます。 　　同じ原理で、単純に抗体を一度剥がしてから、 1次抗体の抗体反応からやり直せば、私の目的は達成できるはずです。 しかし、ストリッピングではメンブレン中のタンパクも一緒に 剥がれてしまう危険性があることが、一番の懸念です。 初歩的なことで大変恐縮ですが、宜しくお願い致します。

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