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(無題) 削除/引用 No.7597-8 - 2019/01/24 (木) 09:55:08 - ぺんぺん ぺんぺんです。 そうですね。レビュアーにプールではなくクローンで、というのは突かれるポイントですもんね。 クローンでやるのがなんだかんだ一番近道ですね。

(無題) 削除/引用 No.7597-7 - 2019/01/24 (木) 01:34:14 - おお Improve CRISPR Knockouts by Using Multiple gRNAs While a lot of focus is generally on design parameters, there are other ways to maximize on-target efficiency and minimize off-target effects. Multiple gRNAs targeting the same gene has also been shown to improve editing efficiency and greatly increase the chance of generating a knockout. https://www.synthego.com/guide/how-to-use-crispr/design-grna-crispr

(無題) 削除/引用 No.7597-6 - 2019/01/23 (水) 19:02:12 - ノックアウト ペンペンさん そうです、サンタクルーズ社で売られているものを見て今回質問しようと思いました。個々のgRNAを使ってやるのが一般的な方法なんでしょうか、というのが質問したかったことです。siRNAの実験でもダーマコンがプールのものを販売しており、それを使って実験した結果について、個々のsiRNAを使って実験し直せとレビューアーから言われた研究者もいると聞いております。当方はプールのものを使用したことがないので経験がありませんが、siRNAの実験と同様にgRNAも個々に使用したほうがいいのかなと思いました。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7597-5 - 2019/01/23 (水) 18:44:45 - AA triple-CRISPRで検索してみてください。 細胞株に対してはどうかとは思いますが、 受精卵に対して高効率に改変を入れるために複数のガイドを入れることはします。 ただ、オフターゲットは必ず指摘されるので、 ロットの異なるファウンダー世代同士で同じ表現型が出ることを確認するようです

(無題) 削除/引用 No.7597-4 - 2019/01/23 (水) 09:11:19 - asan 1. オフターゲットがあるかないかというのをshRNAのようなバルクでの利用はしないし、判断が現実的に難しいので設計の段階で通常は省きます。もっとも完全にオフターゲットをなしにするためには実験的な確認（全ゲノムシーケンス等）が必要だと思いますが、臨床治験でもなければ通常はしないでしょう。 2.2-3gRNAを設計する主な目的はオフターゲットよりも確実にノックアウトできるターゲットを探す（効率の良いもの）目的のほうが強いです。よって、混ぜて利用するのは悪い戦略ではありません。ちなみに切断効率が良くても、indelの位置によってはマイクロホモロジーでin frameでアミノ酸が繋がるものばかりとれることがあります。業者は確実に落とすことで金を取るので、混ぜて確実な結果を出そうとしてるんでしょうが、自分で作るなら不要です。 3.マウスなどの個体作製が目的の場合は、オフターゲットはバッククロスを重ねることで希釈されるので、現状ではそこまでこだわってる人は少ないと思われます。ただ、念のためexon上にオフターゲットの可能性のある配列ぐらいは避けるのが一般的です。 複数のgRNAを混ぜたら当然オフターゲットのリスクも増えるので、一丁一旦です。

(無題) 削除/引用 No.7597-3 - 2019/01/23 (水) 07:24:52 - おお 何を持ってただしいと、、、

(無題) 削除/引用 No.7597-2 - 2019/01/23 (水) 07:24:02 - ぺんぺん ぺんぺんです。 私はこれまで数え切れないほどのノックアウト体を自前でとってきましたが、プールのガイドが売られていますよね。サンタさんとかでも。 まあRNAiを業者さんから購入するとプールで売られてたりもするのでなんとも言えないですが、私は個々のガイドでオフターゲット効果は違うので、個々でノックアウトをとりますね。

crispr-cas9によるノックアウト 削除/引用 No.7597-1 - 2019/01/23 (水) 03:57:35 - ノックアウト ある遺伝子についてノックアウトする際、gRNAを２−３本一緒にトランスフェクションする方法は一般的なのでしょうか？例えばある遺伝子Aに対するgRNAを３−５つ購入し（gRNA1-5）、それぞれのgRNAでノックアウトの株を得た後（５種）、それらがオフターゲット効果を持つのかどうか検証すべきと思ってましたが、ある会社では3つのgRNAを使ってノックアウトを得る方法が売られていました。この方法は正しいものなのでしょうか？

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