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(無題) 削除/引用 No.76-9 - 2012/01/28 (土) 12:48:13 - AP 検証実験お疲れさまです。 原理的にexo-のほうが有利だとは思いましたが。 かつて、自前でライブラリーを作って仕事をするのが当たり前だった頃、lambda armsの末端処理をpartial fill-inでやる方法もありました。 そのころはexo-はなくて、普通のklenowでやったものですが、この方法なら、ほぼ確実にnon-recombinantの出現が抑えられていました。

(無題) 削除/引用 No.76-8 - 2012/01/27 (金) 00:30:15 - アマント > ＞バンドの濃さを比較したときに、5%ぐらいの濃さであったので、5%がligationしていなかったと判断したのですが、 > のところで、ligationしないでPCRすると、何も検出できませんか？制限酵素の切れのこりでもPCRできそうですが、そこはOKでしょうか？ はじめにplasmidを制限酵素で切断し、短かくなった断片をゲルから切り出して使用したので、切れ残りの可能性は無いと思います。 実は、LigationしないでPCRをした場合には、PCRで増幅されてしまいました。アニーリングしてしまっているのが原因だと思います。しかし、ヌクレオチドが導入された場合には、アニーリングできなくなる（はず？）ので、PCRで増えないと考えていました。 ただ、今、考えると、PCRの場合、少しでもテンプレートがあると増えてしまうので、Ligationの効率を調べようと思っても、20%と30%の違いは判別できても、1%や5%といった少量の判別は難しいかもしれないと思いました。

(無題) 削除/引用 No.76-7 - 2012/01/26 (木) 22:56:15 - qq ＞バンドの濃さを比較したときに、5%ぐらいの濃さであったので、5%がligationしていなかったと判断したのですが、 のところで、ligationしないでPCRすると、何も検出できませんか？制限酵素の切れのこりでもPCRできそうですが、そこはOKでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.76-6 - 2012/01/26 (木) 10:54:12 - アマント 皆さま、回答ありがとうございました。 > 「5%近くligationしてしまいました。」ことをどの様に確認したのでしょうか。教えていただけますか？ 確認は、ligationしたときにのみ増幅可能なプライマーを用いて、PCRによって行いました。controlとして、ヌクレオチドを加えずにligationしたものを用いて、controlとバンドの濃さを比較したときに、5%ぐらいの濃さであったので、5%がligationしていなかったと判断したのですが、ご質問を受けて、改めて考えてみると、この方法では、正しくligationの効率が測定できていないかったかもしれないと思い、今回、この回答の下の方に記したように、十分量のplasmidを用意して、電気泳動で直接ligationの効率を測定してみました。 >入れる塩基を１種類にするのではダメ？ dATPだけを加えて、Klenow Fragment もしくは、Klenow exo-で実験をします。Klenow exo-を使った場合に、反応が十分に進んでいないように感じ、どう反応効率を上げられるのか、意見を聞かせてもらえないかと思って質問を投稿させていただきました。 >ライブラリの構築なのでしょうか？ DNAの末端に、アダプター配列をligationによって結合させたいと思っています。アダプター配列のligationの時に、制限酵素で切ったもともとの配列同士が再結合してしまうのを防ぐために、ヌクレオチドを加えて防止しようと考えています。 >普通のklenowでいいはずですけれど。 結局、どちらにすればいいのか分からなくて、網羅的に比較実験をしてみました。実験方法は、Klenow Fragmentと、Klenow exo-の各酵素を使って、30min、1hour、2hourに反応時間を振って、さらに、酵素を過剰に加えた場合についても検討してみました。 反応溶液は、 sample(plasmid) 2ug dATP final 40uM NEBuffer2 final 1x Klenow (or Klenow exo-) 1uL or 3.3uL (合計容量) 120uL Klenow Fragmentは、25度で、Klenow exo-は37度で、いずれもrotationなしで、30min、1hour、2hourの3つの時間で反応させました。 カラムを使ってBuffer交換をした後、750uLのスケールでLigationを行い、フェノクロ・エタ沈の後、1%のアガロースゲルで流してチェックしました。また、残りのサンプルを使って、制限酵素で切った後に、4-20%のgradient gelで流して、ligationしなかったときにだけできる断片が見れるかどうかもチェックしました。 結果は、まず、全条件においてKlenow exo-の方が、Klenow Fragmentよりもligationの効率が悪かったです（= partial fill inがうまくいっている）。Klenow exo-では、反応時間による差は見られませんでしたが、Klenow Fragmentでは、1hourと、2hourでは、inter molecularのligation産物が増えてしまいました。おそらく、exonuclease活性で、一度、結合したヌクレオチドが除去されてしまったためだと思います。酵素を過剰に加えた場合、Klenow exo-では、特に差が見られませんでしたが、Klenow Fragmentでは、わずかに、inter molecular ligation産物が増えてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.76-5 - 2012/01/25 (水) 08:56:46 - ~ ライブラリの構築なのでしょうか？ 95%もセルフライゲーションしなくなるのであれば、十分サブクローニングには使えると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.76-4 - 2012/01/24 (火) 20:55:08 - AP 普通のklenowでいいはずですけれど。 酵素を過剰にしない、室温で反応、反応時間を長くしすぎない（加えたdNTPが枯渇しないように）。cf. Molecular Cloning

(無題) 削除/引用 No.76-3 - 2012/01/24 (火) 20:19:13 - Harmonia 入れる塩基を１種類にするのではダメ？ 何の酵素で切って、何をしたいじっけんなのか、言っていただければ、もう少し考えようがあるけど。

(無題) 削除/引用 No.76-2 - 2012/01/24 (火) 17:45:43 - qq 興味で聞きたいのですが、 ＞確認は、ヌクレオチドを加えた後は、ligationできないことを利用して ＞ligationによって行いました。しかし、 「5%近くligationしてしまいました。」ことをどの様に確認したのでしょうか。教えていただけますか？

Partial fill inに最適な酵素、条件は？ 削除/引用 No.76-1 - 2012/01/24 (火) 09:55:51 - アマント 6bpを認識する制限酵素でDNAを切断し、5'末端が4bp突き出たOver hangになっているDNAがあります。 このサンプルに対して、ヌクレオチドを1bpだけ加えるPartial fill in 反応ををしたいと考えています。加えるヌクレオチドは、通常のヌクレオチドであり、radio labelしたものではありません。 この目的の場合、Klenow FragmentとKlenow exo-のどちらを使うべきなのでしょうか？とりあえず、Bluntingをしたいわけでないので、3'->5'exonuclease活性によって、一度結合したヌクレオチドが除去されないKlenow exo-の方がいいかと思って、Klenow exo-を使ってみたのですが、Partial fill in反応が完全ではないようなのです。確認は、ヌクレオチドを加えた後は、ligationできないことを利用してligationによって行いました。しかし、5%近くligationしてしまいました。 Partial fill in反応に必要な酵素、条件等を教えていただけないでしょうか？

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