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電気泳動するとき、「バッファーが草臥れる」のはなんですか? トピック削除
No.7606-TOPIC - 2019/01/24 (木) 17:20:55 - レベル29のライチュウ
こんにちは。

DNAをアガロースゲルで電気泳動するとき、TAEとTBE二つのバッファーを使いますが、「TAEはバッファーキャパシティーがTBEより低いのでバッファーがすぐに草臥れる」といいます。そしてその故、長く電気泳動するときTAEは途中にバッファーを変わらなければならないと聞きました。

電気泳動するときバッファーが疲れるのは何の意味ですか?
 
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No.7606-6 - 2019/01/25 (金) 12:47:22 - AP
バッファーの成分に「電気分解」して分解する成分があるのか疑問。

>+TBEの場合、ホウ素が酵素の阻害剤なので、電気泳動した後ゲルからDNAを抽出するときよくないとしますが、ホウ酸はDNAと水素結合して酵素を阻害すると聞きましたが、ただ結合する状態だけで酵素が阻害されますか?

抽出過程でバッファー成分なんか除去されるでしょう。
実際、何が問題なのかはわからないけれど、ゲル抽出キットの説明書などから推測すると、
ホウ酸存在下ではゲルが溶けない(カオトロピック剤のグアニジウムと反応?)のか、核酸とシリカの結合を阻害するか、だと思っています。

お返答ありがとうございます。 削除/引用
No.7606-5 - 2019/01/25 (金) 11:57:01 - レベル29のライチュウ
お返答ありがとうございます。

電気泳動中に、極にとってイオンがわかるのですね。

それなら、バッファーが草臥れることはこれと関していますか?私が理解したのは「酢酸がホウ酸より解離される傾向が大きく、バッファーキャパシティーが少ない」ですが、この結論で会いますか?これが完全戻れないから、バッファーを一定周期とか一定回数電気泳動したら変わらなければならないようですね。

+TBEの場合、ホウ素が酵素の阻害剤なので、電気泳動した後ゲルからDNAを抽出するときよくないとしますが、ホウ酸はDNAと水素結合して酵素を阻害すると聞きましたが、ただ結合する状態だけで酵素が阻害されますか?

(無題) 削除/引用
No.7606-4 - 2019/01/25 (金) 08:14:29 - AP
合わせたいpHにpKaが近い方が緩衝能が高いのでホウ酸の方がいい、というのが正解かも

(無題) 削除/引用
No.7606-3 - 2019/01/25 (金) 01:18:33 - おお
電極で加水分解などの反応も起こっていると思うので、バッファーの化学的組成も変わってくると思う。

ただ1回の泳動だと一般的に行っている電気泳動で影響が出るほどではないだろうけど。分極のほうが影響するとおもえるし、じっさいMOPSを使ったようなRNAの泳動ではバッファーを循環させることが勧められている。MOPSの緩衝能が弱いためかとおもう。

(無題) 削除/引用
No.7606-2 - 2019/01/24 (木) 19:19:07 - AP
分極するから。
陰イオン(ホウ酸、酢酸イオン)が陽極に、陽イオン(Tris)が陽極に向かって移動するので、イオンの分布が偏り、pHが狂ってくる。
これはTBEでもTAEでも他のバッファーでも同じ。
だから、大型の泳動槽や高電圧を、長時間の泳動ではペリスタポンプで両極からバッファーを循環させたり、スターラで撹拌したりする。これは、ゲルの温度ムラを防ぐスマイリングを抑える効果もある。

途中でバッファーを取り替えるというのは、新しいバッファーに入れ替えるという事ではなく、途中でかき混ぜるとか、ピペットで一方の極から吸ったバッファーを他方の極に入れる、みたいなこと。

ミニゲル(mupid)程度の泳動槽なら、そんなに熱も出ないし、自然対流や自由拡散でイオンが十分に行き渡るだろうし、泳動中、特に配慮する必要はない。
バッファーを使い回すときに、おまじないで、ゲルをセットする前にちょっと揺らして撹拌する程度。

分極の影響がTAEのほうがTBEのよりも大きいというのはおそらく酢酸とホウ酸、それと核酸のリン酸基のpKaの関係でしょう。酸イオンの分布が陽極側に加重してくると、核酸の電離が抑えられる。このときpKaが小さい(より強い酸)の酢酸だとよりリン酸基の電離を妨げるけれど、pKaの大きいホウ酸だと影響が出にくいとかなんとかじゃないかな。

電気泳動するとき、「バッファーが草臥れる」のはなんですか? 削除/引用
No.7606-1 - 2019/01/24 (木) 17:20:55 - レベル29のライチュウ
こんにちは。

DNAをアガロースゲルで電気泳動するとき、TAEとTBE二つのバッファーを使いますが、「TAEはバッファーキャパシティーがTBEより低いのでバッファーがすぐに草臥れる」といいます。そしてその故、長く電気泳動するときTAEは途中にバッファーを変わらなければならないと聞きました。

電気泳動するときバッファーが疲れるのは何の意味ですか?

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