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non-RI法でのEMSAについて トピック削除
No.761-TOPIC - 2012/07/16 (月) 23:47:35 - uro
NFkBのEMSAを行おうと準備中です。
当方、不慣れで申し訳ありませんがご指導いただければ幸いです。

Panomics社のnon-RIキットを購入予定ですが、当laboの設備の問題等でいろいろ疑問が生じております。試行経験のある先輩がおらず、途方に暮れています。

@gelは6%と指定されていますが、厳守したほうが良いでしょうか。4%もしくは4-15%に対応と書かれたprecast gelはlaboにあるのですが、代用は可能でしょうか。

Amembraneはnylonが指定されています。セルロースとPVDFはlaboにあるのですが、新しく購入したほうが良いでしょうか。

BUV crosslinkerがないので、dry ovenを使用予定です。80℃で60分と書いてあるのですが、前レスを眺めていると「アルミホイルで包む」や、「時間は長いほどいい」などの意見が見られます。経験のある方、教えて頂けないでしょうか。

ご存知の方、宜しくお願い致します。
 
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6件 ( 1 〜 6 )  前 | 次  1/ 1. /1


ありがとうございます 削除/引用
No.761-7 - 2012/07/17 (火) 16:06:52 - uro
みなさま、ご指導ありがとうございます。
まずはベーキングを推奨しているものを選んでメンブレンを決めて、インストラクション通りにやってみたいと思います。
ゲルももう一度詳細を確認してみます。
また壁にぶつかった際には、助けの手を差し伸べていただけると助かります!!

(無題) 削除/引用
No.761-6 - 2012/07/17 (火) 13:20:30 - 初手
まずは、それぞれのツールについて基本情報を勉強しましょう。
メーカーの取り説読むだけでもいのです。

そして、まずやってみましょう。
その結果を見て、泳動像がこうだったからゲルの濃度を上げる、下げるとか。

不慣れだからこそ、まず基本情報を押さえて
実際に動いてみて情報を収集することが大事だと思います。

(無題) 削除/引用
No.761-5 - 2012/07/17 (火) 11:33:00 - AP
>化学発光法(SDP-Star)
CDP-Starのタイポです。

(無題) 削除/引用
No.761-4 - 2012/07/17 (火) 09:42:45 - AP
1) それは核酸泳動に使える非変性ゲルですか? タンパク質用(SDS-PAGE用)ではないですか?最近は泳動バッファーを変えるだけでSDS-PAGEからNative PAGEまでできるプレキャストゲルなんかがあったりするので、断定はできないですが。
EMSAはタンパク質を分離する泳動ではなく、核酸(プローブ)の移動度の違いを見るもので、タンパク質が結合していないときは分画範囲外(分子ふるいにかからなくスッポ抜けてフロントラインに来る)くらいの低濃度が適当です。
またゲル濃度が高いとブロット効率が下がる可能性があります。

2)核酸(プローブ)をブロットするのが目的ですから、PVDFはタンパク質を疎水結合で捕捉するためのものなので論外。ニトロセルロースは核酸にも使われてきましたが、ナイロンが一般的になっている現在では、ニトロセルロースにするメリットは何もありません。ニトロセルロースはプロットのキャパシティー、固定化したときの結合強度、物理的・化学的強度全てに劣ります。低分子のプローブを結合する必要のあるEMSAではポジティブチャージのナイロンを使わないとブロット効率が著しく落ちるでしょう。また、化学発光法(SDP-Star)はニトロセルロースでは性能を発揮できません。

3)メンブレンメーカーのインストラクションに従ってください。
ニトロセルロースの場合は80Cでやりますが、熱に強いナイロンではもっと高い温度(100 C, 120 C)で30分程度のベイキングを推奨している製品もあります。
また、UVクロスリンカーはEtBrゲル観察用のUVイルミネータでも代用できます。最適化するには、標品(例えば自作あるいはキット付属のコントロール用プローブ)をスポットして照射時間を振り、検出強度を比較するなどが必要です(ふつう最適時間は1-3分位)。しかし、UV照射による核酸の切断、ピリミジンダイマー形成、過架橋によってプローブのハイブリが妨げられ感度が下がるサザン・ノーザンハイブリとちがって、プロットした核酸に直接ラベルが付いているEMSAでは、照射過剰長でも感度が下がる心配が少ないので、最適化せずとも、充分長めに照射しておけばいいかもしれません。

初めてやることですから、極力、メーカのインストラクションに従いましょう。じゃなきゃ、うまくいかなかったとき、何が原因か突き止めにくくなります。

(無題) 削除/引用
No.761-2 - 2012/07/17 (火) 08:13:12 - Harmonia
(1) ゲル濃度
ゲル濃度が違うと、結果にどう反映されるかを考えてください。
その上で、自分が表現したい結果に近い映像が、濃度が4%のときに得られるのか6%のときにえらるのか、あるいは5%のときなのか、やってみないとわからないときがあります。

(2) メンブレンの材質
メンブレンの材質が変わると、何が変わるか、メーカーのカタログをよく読んでください。材質により、吸着しやすいものとか吸着しにくいものがありますし、同じ材質でも、どのサイズは吸着しやすいとかしにくいとかありますので。

(3) UVクロスリンクとベーキング
UVクロスリンクやベーキングの結果、何が起こるか、おそらくメンブレンのメーカーカタログにも記載があると思います。また、どちらが良いかとかどちらもだめとかの記載もあると思います。
UVクロスリンクでもベーキングでも、他のラボの条件がぴったり自分の条件に当てはまるとは限らないので、ベストな画像を得るためには、時間とか強度を変えた予備実験が必要です。グラフで表すと、縦軸を画像の良さ、横軸を時間とか強度としたとき、概ね、オワンを伏せた形になります。

non-RI法でのEMSAについて 削除/引用
No.761-1 - 2012/07/16 (月) 23:47:35 - uro
NFkBのEMSAを行おうと準備中です。
当方、不慣れで申し訳ありませんがご指導いただければ幸いです。

Panomics社のnon-RIキットを購入予定ですが、当laboの設備の問題等でいろいろ疑問が生じております。試行経験のある先輩がおらず、途方に暮れています。

@gelは6%と指定されていますが、厳守したほうが良いでしょうか。4%もしくは4-15%に対応と書かれたprecast gelはlaboにあるのですが、代用は可能でしょうか。

Amembraneはnylonが指定されています。セルロースとPVDFはlaboにあるのですが、新しく購入したほうが良いでしょうか。

BUV crosslinkerがないので、dry ovenを使用予定です。80℃で60分と書いてあるのですが、前レスを眺めていると「アルミホイルで包む」や、「時間は長いほどいい」などの意見が見られます。経験のある方、教えて頂けないでしょうか。

ご存知の方、宜しくお願い致します。

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