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2つの遺伝子を同時に発現する トピック削除
No.7690-TOPIC - 2019/02/15 (金) 01:08:08 - Kent
このサイトでも何度かとっぴくに上がったと思いますが、改めてお伺いしたいです。
表題にあるように２つの遺伝子を同時に哺乳類細胞に発現させようと思っていますが、T2Aはいくつかの論文を見ると、かならずしも100％の効率ではなさそうで、少量の融合たんぱく質が認められていますが、実際に経験のある方はいらっしゃいますでしょうか？また、最終的なタンパク量に何かしら影響されるものでしょうか？
また、IRESはsecond geneの発現がかなり落ちる印象を持っています。これは翻訳効率が悪いためと認識しています。
質問は、first geneの発現もIRESがあることにより影響されるものでしょうか？
pcDNAなどの一般的なベクターで単独で発現させる場合と、例えばCMV-first gene - IRES - GFPで発現させる場合、first geneの発現量が変わるかが知りたいです。
IRES-GFPが3'にあることにより、mRNAの安定性、核外輸送、または翻訳に影響するかが知りたいです。
論文にありそうで、だいぶん前に見た気がするのですが、見つからないです。
経験のある方、ぜひお教えください。
　
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(無題) 削除/引用
No.7690-5 - 2019/02/17 (日) 00:43:58 - Kent
Karasさん、

大変貴重な情報をお教えいただきありがとうございます。
IRES下流の遺伝子の発現をわざと落としているとは知りませんでした。
P2Aについても検討したいです。
大変参考になりました。

おおさん、
論文紹介ありがとうございます。
この実験ではなるべく同じプロモーターから発現させたいために、dual expression vectorではなく、IRESかT2Aを考えていました。
２つの遺伝子を同じプロモータをもつ種類のベクターに入れて、co-transfectionするというのももちろん考えましたが、この場合、転写因子などが競合すると思い、これも除外していました。

(無題) 削除/引用
No.7690-4 - 2019/02/16 (土) 18:43:21 - おお
そういえばDual expression vectorを使えば一つのプラスミドで２つの発現したい遺伝子を発現できますね。

(無題) 削除/引用
No.7690-3 - 2019/02/16 (土) 15:24:29 - Karas
私はT2AではなくP2Aを使っていますが、多少融合したところで問題ない実験でもあるので気になったことはありません。それよりか2A系統は上流のタンパク質に17aa程度、下流に1aa余分なアミノ酸が付くのでその為に使えないことはあります。

IRESにもいくつもの種類がありますが、中でも一番良く使われているEMCV由来IRESは、昔からIRES下流の発現量が非常に落ちるとかIRES前後の発現量が非常に不均等になると言われています。実は歴史的な背景もあり複数の変異体が存在しているのですが、ほとんどの論文がEMCV IRESのどの変異体を使ったのか記載してないので混乱に拍車が掛かっています。
市販されているIRES配列は下流の発現量を下げる変異がわざと入れてあるもので、ウイルス本来の配列に直すことで下流の発現がだいぶ増えるとの報告があります。

個人的にはクローニングのし易さや発現量コントロールを別々に出来ることを考えると、細胞にプラスミドで一過性に発現させるだけであれば別々のプラスミドの上に遺伝子を載せます。そうでなければ2Aで繋げ、それでも難しければプロモーターを２つ同じベクターに載せて別々のmRNAから2種類の遺伝子を発現させるでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7690-2 - 2019/02/15 (金) 07:17:44 - おお
first geneの発現もIRESがあることにより影響されるものでしょうか？
http://www.jbc.org/content/282/1/132.full.html

2つの遺伝子を同時に発現する 削除/引用
No.7690-1 - 2019/02/15 (金) 01:08:08 - Kent
このサイトでも何度かとっぴくに上がったと思いますが、改めてお伺いしたいです。
表題にあるように２つの遺伝子を同時に哺乳類細胞に発現させようと思っていますが、T2Aはいくつかの論文を見ると、かならずしも100％の効率ではなさそうで、少量の融合たんぱく質が認められていますが、実際に経験のある方はいらっしゃいますでしょうか？また、最終的なタンパク量に何かしら影響されるものでしょうか？
また、IRESはsecond geneの発現がかなり落ちる印象を持っています。これは翻訳効率が悪いためと認識しています。
質問は、first geneの発現もIRESがあることにより影響されるものでしょうか？
pcDNAなどの一般的なベクターで単独で発現させる場合と、例えばCMV-first gene - IRES - GFPで発現させる場合、first geneの発現量が変わるかが知りたいです。
IRES-GFPが3'にあることにより、mRNAの安定性、核外輸送、または翻訳に影響するかが知りたいです。
論文にありそうで、だいぶん前に見た気がするのですが、見つからないです。
経験のある方、ぜひお教えください。
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