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(無題) 削除/引用 No.7696-9 - 2019/02/23 (土) 17:32:51 - １２３４ 切りました、と一言書いておけばそれで良いのではないでしょうか。その可否はエディター／レビュアーの判断に任せれば。とくに一度は全体を見ていて、どんなふうになるかわかっていて、論文用にきれいなデータを取り直すみたいなときは切ってもいいとおもいます。 結構、extra bandsが重要な示唆を与えることがあるので、見たい部分だけしか見ないと、思いがけない発見を逃す可能性があるのでそれはいつも留意したほうがいいです。 見たいとこだけ見る場合：シグナル減少した→発現低下ということで終了。 全部見る場合：シグナル減少した→だいぶ下の方にバンド出現→限定分解か？、シグナル減少した→代わりにゲルのトップにスメアなシグナル出現→UB／UBL化？みたいなかんじで。

(無題) 削除/引用 No.7696-8 - 2019/02/23 (土) 06:18:33 - 追加質問です。 みなさま、ありがとうございます。 複数のメンブレンが必要な場合も多々ありますが、やはり可能であれば1枚のメンブレンでリブロットして複数の抗体を染めたデータの方が信頼性が高い気がします。 複数のメンブレンを使用する際はサンプル量を変わっていないことを示すためにもすべてのメンブレンで内在性コントロールを確認すべきですね。 もう一つ確認したいのですが、メンブレンを再度作成しなければならない場合、同じサンプルを前回と同様に濃度調整し、同じ条件で流したものであれば同じデータに載せて問題ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7696-7 - 2019/02/23 (土) 01:13:26 - むしろ労力を惜しみます どちらでもいいと思います。 切り取る場合はわざと少しジグザクもしくは段差をつけて切れば一枚のゲルからというのが分かりますね。 ２つの抗体が相互に干渉しないなら、本命で染めてから、アクチンなどで染めて構いません。 私は、２度えいどうするなどのむしろ労力を惜しみますね。また、捏造の機会は２度えいどうしたほうが増えますよね。サンプル量を違えるとか。

(無題) 削除/引用 No.7696-6 - 2019/02/22 (金) 10:45:14 - asan >また内在性コントロールで半定量化する際、それぞれメンブレンについて内在性コントロールと比較されていますか？ 正直WBの半定量については、ケミルミは定量性にかけるし、imageソフトで輝度を定量するのはかなりいい加減なものだと思った方がいいです。蛍光を使えばマシだという人はいますが、電気泳動のバンドパターンや抗体の染まり方によってもかわるので、丁寧にやったからOKというよりは、定量データをざっくりでいいから示したい程度の認識だと思った方がいいです。 その意味では内標と同じメンブレンからとった方が丁寧で、最近のデータ改ざんの流れもあり、できるだけそうするとかリブロットを推奨するが、のような投稿ガイドラインになってるジャーナルもありますが、現状では、泳動のレプリカを作成してやる方が一般的だと思います。 Wholeのメンブレンを出すのはあくまで生データーを都合の悪いデータを隠す形でやってないことを示すことが目的でもあるので、バンドギリギリで切り取りしたわけでないなら元のデータを分子量マーカと一緒に表示して提出すれば通常は問題ないです。最近はコントラストとかもうるさいですね。

(無題) 削除/引用 No.7696-5 - 2019/02/22 (金) 05:36:18 - おお WBだと同じメンブレンでInternal controlと比べたい蛋白の検出ができますが、例えばアッセイ系が違うとオリジナルの溶液から、Internal control用、テスト用別々にとってそれぞれアッセイすることになります。WBが同じメンブレンを使わなければいけない理由があるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7696-4 - 2019/02/22 (金) 02:39:53 - 追加質問です。 とても興味のあるトピックなので、追加で質問させてください。 抗体の数が多い場合、同じサンプルを同じ蛋白量に調整したもので複数のメンブレンを作成しています。 質問は、すべてのメンブレンについてactinなどの内在性コントロールを確認されていますか？ また内在性コントロールで半定量化する際、それぞれメンブレンについて内在性コントロールと比較されていますか？ figureを作る際は一つのメンブレンの内在性コントロールしか載せないのでどうされているのかなと思いまして。 （全てのサンプルで内在性コントロールは均一に揃っていた場合です。）

(無題) 削除/引用 No.7696-3 - 2019/02/18 (月) 04:55:44 - Mac > ただラボ内には膜を切断している方も多く、それでもいいのでしょうが、ただいざ論文にするとなるとどういう対応をされるのかな？と疑問に思います。 > そこで皆様にお聞きしたいのですが、もう今ではPVDF膜を切断して複数の抗体でブロットするようなことはしない流れになりつつありますか？ 特異性が確認されている抗体の場合は、膜を切ってブロットしてます。論文にする時も、半分だけのブロットのオリジナルスキャンをサプルメントに付けて投稿してますが、問題になった事は今のところないです。 > 私は百歩譲っても、初めて使う抗体は1度でwholePVDF膜で染めた方がいいと思います。 > それはやはり特異性なのかどうか、どれだけのバンドが出るのか、などをあらかじめ知っておいた方がいいと思うからです。皆様はいかがですか？ この点は完全同意します。初めての抗体の時はそうしてます。

(無題) 削除/引用 No.7696-2 - 2019/02/16 (土) 13:47:23 - toto ちょうど、昨日、JBCからデータの取り方の具体的なルールが出ました。 http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data これによると、blotのは下のほうにありますが、ゲル全部でなくても、分子量マーカーを含むある程度の幅があればよいようです。実際に、ゲルの全体と言っても、すべての分子量サイズをカバーしてるわけではないわけですし。ほかの雑誌でも、ゲルの全体でなくて高分子領域やある範囲しかないblotでも、markerさえあって極端に狭い範囲でなければ、受けつけてるとおもいます。blot全体をとはいわれますが、ゲルの全体を、ではないので。 ただ、なるべく広い範囲を示した方が印象は良い気はします。また、はじめて使う抗体はその通りと思いますが、その辺は投稿とは別の話ですね。

複数の抗体でウエスタンする際は膜をMWで切り分けますか？ 削除/引用 No.7696-1 - 2019/02/16 (土) 02:40:03 - PVDF お世話になります。 私が大学院生だった頃（10年ほど前）、ウエスタンで複数の抗体でブロットする際にはPVDF膜を分子量で切り分けていました。 例えばPDGFRは高分子量域、アクチンは低分子量域というように膜を切断していました。 中には3つに切断したこともあります。 ただ最近といいますか、現在の主流はどうでしょうか？ 多くのハイインパクトな雑誌ではwholeメンブレンを示すように言われます。 示した中で、ここを切り取りデータ化しましたというように枠で囲むこともしばしばです。 私は新たなラボに移ってからは、wholePVDF膜を一つの抗体でブロットするようにしています。 その後、ストリップせず、アクチンやらGAPDH等をみます。 中にはストリップすることもありますが、それでもどちらかといえばもう一度ゲル泳動から始めた方が綺麗なデータとなるので、その労力は惜しみません。 ただラボ内には膜を切断している方も多く、それでもいいのでしょうが、ただいざ論文にするとなるとどういう対応をされるのかな？と疑問に思います。 そこで皆様にお聞きしたいのですが、もう今ではPVDF膜を切断して複数の抗体でブロットするようなことはしない流れになりつつありますか？ 私は百歩譲っても、初めて使う抗体は1度でwholePVDF膜で染めた方がいいと思います。 それはやはり特異性なのかどうか、どれだけのバンドが出るのか、などをあらかじめ知っておいた方がいいと思うからです。皆様はいかがですか？

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