全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

もはや頼んだ方が・・・ 削除/引用 No.7701-19 - 2019/06/02 (日) 12:38:24 - 名無し 人工遺伝子もベクターにクローニングされていない2本鎖DNAなら自作するより安くて速いかもしれませんよ。 たとえばGENEWIZのFragmentGENEは250bpで7500円と30円/bpですからね。 オリゴ頼んで自作するとなるとオーバーラップ領域も必要なのでもっと高くつくでしょう。 https://www.genewiz.com/-/media/Files/Japan/GWJP%E4%BA%BA%E5%B7%A5%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%E5%90%88%E6%88%90_v1-4_PrintableA4.ashx

(無題) 削除/引用 No.7701-18 - 2019/06/01 (土) 20:50:46 - くわがた 投稿から数か月経ちますので今さらですが、 昔、ゲノム編集ベンチャーのSangamoのグループがZFNを人工合成するときに、プライマーを繋げて仰ってるような方法で目的を達成しているのを見たことがありました。 http://www.jbc.org/content/275/43/33850.full ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.7701-16 - 2019/02/23 (土) 03:24:19 - おお >…がしかし、やはりそもそも前回の「"Purification PCR"って必要か…？」につながりますが、長い中間産物をそれ自身プライマーとして増幅しても別に全く問題ない気もしますし できなくはないです。PCRでなくとも、クレノーなどのポリメラーゼで１段階の伸長でということも考えられなくないし。ただ長いプライマーはアニーリング温度をいじれないなどPCR条件をあわせる術がないです。 またよくやられるのはPCR断片をつなげたりするときに使われるので両末端のプロダクトが５００bpだったりとかいうこともあります。５００bpでもプライマーとして使用できなくもないんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.7701-15 - 2019/02/21 (木) 11:13:08 - moz > >一本鎖オリゴを「bp」と書くのはおかしくないか その通りですね。申し訳ないです。 頭では"base"と思っていても"bp"って反射的にキーを打ってしまいます。気を付けます。でも"kb"に関しては”kbp"とは書かないなあ〜。

(無題) 削除/引用 No.7701-14 - 2019/02/21 (木) 08:19:23 - おお >一本鎖オリゴを「bp」と書くのはおかしくないか そういう指摘ならそのとおりです。お詫びいたします。

(無題) 削除/引用 No.7701-13 - 2019/02/21 (木) 06:44:47 - Short おおさん、ちょっと分かりづらかったですが、話の本質は一本鎖でも二本鎖でも変わらないんですけど、言いたかったのはそうではなく、一本鎖オリゴを「bp」と書くのはおかしくないか、あるいは最近はそういうサービスもあるので本当に二本鎖の話をされているのかどうか少し気になった、というお話でした。 いずれにせよ本質的ではない瑣末なことには違いないですね。 繰り返しですがどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7701-12 - 2019/02/20 (水) 16:47:46 - おお >お二方ともbpとおっしゃってますが、一本鎖オリゴの話ですよね？ 一本鎖オリゴでも２本鎖のDNA断片でも一緒ですよ。

(無題) 削除/引用 No.7701-11 - 2019/02/20 (水) 10:00:19 - Short mozさんどうもありがとうございました。 そもそもPCRで鋳型を多く入れない方がいいというのも、何も考えずにそうしてましたが、非特異な増幅産物をなるべく避けたいのがその主な理由でしょうし、余計なものは持ち込まない・少なく済むものはなるべく少なく…というのは、上手い実験の鉄則かもしれませんね。 1つ気になったんですが、お二方ともbpとおっしゃってますが、一本鎖オリゴの話ですよね？揚げ足取りじゃないですが、最近は二本鎖での供給もありますし、微妙に気になりました。 実際二本鎖DNAであるIDTのgBlocksとかも以前使ってみましたが、実にナイスでした。 https://sg.idtdna.com/jp/site/custom_gblocks.html 企業の開発努力・価格改善努力には頭が下がる思いでいっぱいですね。今後もますます便利になることを期待したい限りです。

(無題) 削除/引用 No.7701-10 - 2019/02/20 (水) 09:13:29 - moz >[Re:9] Shortさんは書きました : > （略）成り立ってるならどっちでも好きなほうやればいいじゃん」という話 この通りです。 一応理論的な？背景としては、余分なミスアニールが減るかも＋両端のオリゴが多い方が全長PCR産物が多くなるかな、という程度です。制限酵素を使わないでTOPOクローニングを汎用することも理由になるかな。論文投稿時にも「遺伝子合成した」くらいしか記載しないし。。 ちなみにオリゴメーカーは毎年のように条件が良いところに変えています（年々安くなりますよ!）が、今年は80bpまでがゲル濾過グレードで安価なところですね。（遺伝子合成時には数回しか使わないので）収量はとても少なくてもよいから長い方が良いのだけど。150bpは魅力ですね。

(無題) 削除/引用 No.7701-9 - 2019/02/20 (水) 08:28:58 - Short 何かごちゃごちゃ長くなったんですけど（よく考えたら「全長の増幅には1:1:1:1の比で各オリゴを使う」は誤りでしたしね）、質問のポイントは、「1:1:1:1の比でオリゴを加えることに、明白な不都合や避けるべき点は存在するのか？」ということです（＝「1:0.1:0.1:1の方が確実に好ましい理由はあるのか？」）。 結局これも「最終的にはシークエンスを確認するわけで、理論上系として成り立ってるならどっちでも好きなほうやればいいじゃん」という話かもしれませんが、やはりお作法としての正しさも気になります。 ご意見ありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.7701-8 - 2019/02/20 (水) 06:01:47 - Short 皆様、たびたびありがとうございます。 おおさんの言われるとおり、「人による」が結論で、いずれにせよ結果をきちんと検証するステップは必要であり、手技にこだわらず最終的に正しいモノが得られるならそれでええやん、って話なのかもしれないですね。 asanさんの交渉うんぬんは、実験の本質から逸れますけどそういうのも意外と楽しいんですよね。盲目的にIDTを使ってましたが、別の所を調べてみるのも面白そうです。んなことやってる暇あったら実験せぇよ、って話かもしれませんが。 実はわざわざコメントしたのは改めて質問したいことがありまして、mozさんの「中央の2本のオリゴは1/10濃度」について、これ実際調べてて他でも目にしたんですが、一体どういう意味があるんでしょう？ 結局全長の増幅には1:1:1:1の比で各オリゴを使うわけで、あえて真ん中を低くすることに何らかの意味があるのだろうか…？とずっと気になってました。 …あ、今冷静に考えたら、何となく分かった気もしてきました。(今回の例は1反応のみなので厳密には違いますが)おおさんの最初に示していただいたページにある"Purification PCR"のように、途中長くなった産物が増えていっても、最終的になるべく両端のオリゴで全長増幅をかけるため、ってことなんですかね？ …がしかし、やはりそもそも前回の「"Purification PCR"って必要か…？」につながりますが、長い中間産物をそれ自身プライマーとして増幅しても別に全く問題ない気もしますし（というかそれらが全長まで増えることを期待してるわけですし）、両端オリゴをあえて増やす本質的な意図はどうにも掴みかねます。 そうした方が○○の理由でよいと思われる、みたいなロジックがありましたら、ご教示いただけると大変幸いです。長々と何度も失礼しました。 ※あ、でもやっぱり、「全長まで増えたものが最悪1分子でもあれば、あとはそれを鋳型として、両端のオリゴを使う形で、よくある従来のPCRと同じになる。普段のPCRでも、添加する鋳型の量は極小だろ？」ってのが答ですかね、冷静に考えたら。何か言ってることごちゃごちゃですみません。

(無題) 削除/引用 No.7701-7 - 2019/02/20 (水) 02:32:26 - おお 全部プライマーを混ぜて一気にやる人もいると思いますし、ステップを踏む人もいると思います。

(無題) 削除/引用 No.7701-6 - 2019/02/19 (火) 19:35:55 - asan うちは150bpsまでは一律最安値価格で納品してくれる業者をうまく交渉してるので、 ぶっちゃけ250bpsぐらいまでは日本プライマーで注文してそのままPCRかけて終わりですね。 数千円ぐらいでできます。 ただ、塩基配列が長くなるとプライマーエラーの可能性も上がるのでこのような場合は注意が必要です。 出入り業者にうまく交渉して激安価格で降ろしてくれる業者を探してもらえば結構値引きしてくれる 可能性はありますよ。 できれば、他のラボとかを巻き込んで量で勝負できるといいんですけど、A社からB社へ乗り換えるとか、 関係ラボのつながりで具体的な数字で交渉するとかやり方は色々あると思います。

(無題) 削除/引用 No.7701-5 - 2019/02/19 (火) 09:08:37 - moz ＞1つのチューブに4種類のオリゴを入れて1回のPCRでおしまい ＞"Purification PCR（？）”　というか私は全長PCRと呼んでいます。 私も＜500bp程度なら1回のPCRで終わり（4本のオリゴなら中央の2本のオリゴは1/10濃度にしていました）ですが、IRES配列のような特殊な配列を含む600bp~3kbほどだと成功率が低いので、300bp程（オリゴ4〜6本分）ずつPCRを分けて行っていました。 ですがこうなると、Shortさんの質問の意図から外れていますね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.7701-4 - 2019/02/19 (火) 08:52:48 - Short おおさんmozさんありがとうございます。 1つのチューブに4種類のオリゴを入れて1回のPCRでおしまい、のつもりでしたが、おおさんのお示しになった情報＆mozさんのアドバイスからして、2本のプライマーの反応を、それぞれ分けてやるべきなんでしょうか？ "Purification PCR"も、いらなくない？と思うんですが、どうなんでしょう…？既に全長はできてるわけですし、いたずらにPCRサイクル数を増やすだけで、特にメリットはないように思えますが…。 物によってはoverlapが9とか10塩基とかなので、下手したら上手く増えてくれないため、その際は橋渡しのオリゴを追加してみようと思います(下手にoverlapにゆとりを持たせて1本長いオリゴを増やすより、上手くいかなかったときに短めの橋渡しオリゴを追加する方が安上がりなので。まぁ失敗したときの時間とか手間考えると、ギリギリを攻めず最初から安全さを追求すべきかもしれませんが)。 ご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7701-3 - 2019/02/19 (火) 07:26:51 - moz >Forward1にReverse2, 3, 4と並べる感じ では無く、F1&R1, F2&R2,....の方が早いですよ。 Overlapは15~20bpほどで作製していました。全長PCR・シークエンス確認の20bp程度のオリゴプライマーも場合によっては作製します。 今はシークエンス確認費用・人件費等も考えると海外メーカーが安価なので自作はしなくなりましたが。

(無題) 削除/引用 No.7701-2 - 2019/02/18 (月) 18:34:21 - おお Overlap PCR https://openwetware.org/wiki/PCR_Overlap_Extension

微妙な長さのDNA鎖をオリゴのPCRで作る 削除/引用 No.7701-1 - 2019/02/18 (月) 15:55:46 - Short 最近はそれなりの長さのDNA二本鎖合成サービスも各社出ていると思いますが、それを頼むほどではない、例えば200 bpぐらいの断片が欲しい場合、通常の合成オリゴを何本か頼んでそれらをPCR増幅した方が安く上がります。 現在使っている企業は、まぁIDTなんですが、60 basesまでは格安の最小ロットで合成可能なため、末端の制限酵素サイト＆各オリゴのオーバーラップを考慮して、3本〜4本の60 merのオリゴを頼めば大体200 bpぐらい（場合によっては150 bpとかを作りたいこともあります）の断片を作れるんですけど、Forward1にReverse2, 3, 4と並べる感じで、理論上、順番に伸展していって増幅してくれますよね？ 最大60 merの制限があるため、場合によっては結構ギリギリの数を攻めることになるので、オーバーラップの塩基数が少なすぎて増えない可能性もあるんですけど、その場合は各オリゴの末端を橋渡しする形の、オーバーラップ領域の塩基数を稼ぐ短いオリゴを追加で注文すれば増えなかったF1, R1, R2...が無駄にはならず大丈夫かなと思うのですが、5本も6本もオリゴを加えてPCRをかけることに何か問題はあったりしますでしょうか…？ 多分大丈夫だと思うんですが、他に何か賢い案がある方いらっしゃいましたら、その点含めアドバイスいただけると大変幸いに思います。よろしくお願いいたします。

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---