Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

WBでの標準化 トピック削除
No.7711-TOPIC - 2019/02/22 (金) 16:57:42 - lipid
WBで定量的なとらえ方、又はそうではなく増減をある程度示す実験でも、
標準化を考慮しないわけにはいかないと思います。

単純にコントロールを何にするのかと言う基準の話ですが、
どの程度気にされていますか？

例えば、GAPDHを用いた場合でも実験系によっても適否を指摘できる場合もあると思います。
ただ、RTならまだしもWBの場合はどの程度の範囲で捉えられているのでしょうか？

TG合成が促進されたと言う実験で、因果関係はあるようでなさそうなGAPDHを使用する場合とか。
明らかにGAPDHの発現が向上するようなインシュリン刺激実験とか、ある種のがん細胞におけるGAPDHの発現亢進が分かっている場合など。。。
RTだと考えますが、道南でしょうか。

条件揃えたりすればクリアできる話なこともありますが、
どの程度神経使って選んでますか？
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.7711-4 - 2019/02/23 (土) 15:19:31 - drftbhyjぬ
内部標準蛋白質は、どんなものでも変化しないという確実な保証はないので、あくまで、当事者判断で、この実験ではこの分子はあまり関係ないので（たぶん）変化しないだろうとういことで、経験的に選択しているのが現状とおもいます。
一度、内部標準として定番の蛋白質が処理群で有意性をもって減少していて、その内部標準で計算すると、実際に見えてるデータとグラフが逆になってしまうことがあって、何これ、どの画像のグラフよ？みたいになったことがありあます。
WBの後で膜上の総蛋白質をCBBとかamid blackとかで染色してそれをレーン全体として定量した値をつかうとかすれば、あるていど均一化できるとおもいますし、今は基本的にそうやってます。見えてる画像データとグラフもよく一致してます。レビュアーから叱られた事はありません。

(無題) 削除/引用
No.7711-3 - 2019/02/23 (土) 05:47:16 - Mac
GAPDHのような酵素系、アクチンやチュブリンのような細胞骨格系、あとシグナル伝達系のリン酸化タンパク検出のコントロールとして非リン酸化タンパクを含めて検出する抗体（例えば、pan-AKT抗体など）を使い分けています。総タンパク量で調整してあるので、内部標準はそんなにブレない前提で実験しており、一種類の内部標準でほとんどブレがなければ、それでおしまいにしてます。

もし、一部のレーンでブレが見られ、その原因が不明な場合は、まずは膜をアミドブラックなどで染めてみて、タンパク全体としては問題がない事、局所的な転写不良がない事、などを確認します。その上で、もう一回SDS-PAGEを流し、異なる内部標準マーカーでブロットしてみて、同じ傾向が見られるかどうか見ます。全てのマーカーで一定の傾向が見られる場合は、さらなる検討が必要（タンパク抽出法、細胞刺激条件など）と考えますが、一定の傾向が見られず、マーカによってはブレがない場合は、ブレのないマーカーを内部標準として使ってます。ちょっと雑ですが、ウエスタン自体がそれほど定量的な実験ではない（検量線をきっちり描いて定量した場合は別です）ので、許容範囲内と考えています。

(無題) 削除/引用
No.7711-2 - 2019/02/22 (金) 18:08:39 - おお
＞例えば、GAPDHを用いた場合でも実験系によっても適否を指摘できる場合もあると思います。
＞ただ、RTならまだしもWBの場合はどの程度の範囲で捉えられているのでしょうか？

RTならまだしもというのは通用しないと思います。それでもそういう論文があるかもしれませんけど、それはたまたまRefereeがスルーしてしまったのか、GAPDHでInternal Controlとして成り立つ事がなんらかの情報か実験から示されている場合でしょう。

そもそも「WBの場合はどの程度の範囲」と質問されても、どのように答えればいいのか、、、ＲＴよりラフでもよいとか、RTと同等の基準でよいとか言われて納得しますか？

WBでの標準化 削除/引用
No.7711-1 - 2019/02/22 (金) 16:57:42 - lipid
WBで定量的なとらえ方、又はそうではなく増減をある程度示す実験でも、
標準化を考慮しないわけにはいかないと思います。

単純にコントロールを何にするのかと言う基準の話ですが、
どの程度気にされていますか？

例えば、GAPDHを用いた場合でも実験系によっても適否を指摘できる場合もあると思います。
ただ、RTならまだしもWBの場合はどの程度の範囲で捉えられているのでしょうか？

TG合成が促進されたと言う実験で、因果関係はあるようでなさそうなGAPDHを使用する場合とか。
明らかにGAPDHの発現が向上するようなインシュリン刺激実験とか、ある種のがん細胞におけるGAPDHの発現亢進が分かっている場合など。。。
RTだと考えますが、道南でしょうか。

条件揃えたりすればクリアできる話なこともありますが、
どの程度神経使って選んでますか？
全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。