全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.7734-9 - 2019/03/07 (木) 06:57:33 - おお 一度弱酸性条件下（pH６.４）でミトコンドリアをDigitonin存在下で処理しようとしたことがありますが、収量が低くうまく行ってないことがありました。酸性ではミトコンドリアを扱うのは面倒なのかなという印象でした（あまり科学的な話でないですけど）。 ＞具体的には、超音波処理を行う時点での懸濁液のpHを最終の測定を行う際のpHよりも低いものを使用すれば、ATP合成が行われるのでは、、と考えています。 それはなにか文献でうまく行っていることが示されてますか？ まずはpHをいじらない方法で収量などを確認してそれでうまくいくのであるならpHをいじったことが原因で収量が減ったのかわかると思いますが。 じっさいSMPはどうもクリステの構造を取り出したような感じですが、この粒子は完全に内部は閉鎖されているでしょうか？クリステの根本にタイトな蛋白の構造体がありますがそこをある程度すり抜けられるならもしかしたらと思いますが、、、、 もしほんとに完全に内部が閉鎖されていたなら、Complex 1 to 4の活性は見られているのでその活性で内部にプロトンを送り込めるでしょう。そちらのほうがやりやすいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7734-8 - 2019/03/06 (水) 17:26:53 - cDNA 本当は酸素電極でstate3とstate4を観察出来ればATPが合成されていると判断出来るけど、多分NADH oxidase活性でもADPありなしの差が見えると思う。難しいことの前にここまでの確認がおすすめ。

(無題) 削除/引用 No.7734-7 - 2019/03/05 (火) 21:04:45 - おお cDNAさん 超音波処理の回数について、検討させて頂きます。 ありがとうございます。 すみません。 呼吸基質は加えたうえで、測定を行おうと考えています。

(無題) 削除/引用 No.7734-6 - 2019/03/05 (火) 18:10:13 - cDNA 論文を見た感じだと、超音波の条件がマイルド過ぎるように思います。回数を増やしてみたらどうでしょうか。 また、pH変化でATP合成量を測れるのですか？そこがそもそも難しいように思います。内部にpHを下げたSMPを作っても、そのプロトンで作れるATP量なんてかなり少ないと思いますが、NADHやコハク酸で呼吸鎖を動かすのではダメなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7734-5 - 2019/03/05 (火) 16:48:20 - おお おおさん Inside outは、内膜を反転させるという認識でよろしいでしょうか？ もしそうならば、その通りです。 プロトン自体は、SMPを調製、具体的には、超音波処理を行う時点での懸濁液のpHを最終の測定を行う際のpHよりも低いものを使用すれば、ATP合成が行われるのでは、、と考えています。 最終的にはAACの阻害剤について研究を行う予定なので、 SMPsを調製することが必要になっています。

(無題) 削除/引用 No.7734-4 - 2019/03/05 (火) 16:41:36 - おお cDNAさん ありがとうございます。 上手くいっていないのは、ATP合成が見えないという点の他にも、SMPsの収量が文献値よりもかなり低く出てしまっているということがあります。 呼吸鎖の活性などは、文献値と比較していないため、比較を行おうと思います。 作製法はWilliam Sの手法を参考にしています。 http://www.jbc.org/content/254/16/7717.long SMPsは超遠心で、回収しています。 ATP合成はpHメータを用いて、ATP合成時のプロトンの変化量から計測しています。

(無題) 削除/引用 No.7734-3 - 2019/03/05 (火) 16:40:37 - おお 亜ミトコンドリア粒子はInside outになったものを作ろうとしているのでしょうか？ 私は詳しくは分かりませんがそうだとしたらプロトンを何らかの形で膜の中に送り込まないとATP合成できませんよね。もしくはオリゴマイシン感受性ATPase活性をはかる手はあるかもしれません。 Complex Iなどからのカップリング反応でATP合成を見ていいのなら亜ミトコンドリア粒子よりIntactなミトコンドリアをつかえばいいです。

(無題) 削除/引用 No.7734-2 - 2019/03/05 (火) 15:25:06 - cDNA SMPは凍結保存したミトコンドリアから作ることが多いので、それ自体は問題ではないと思います。うまく行かないとは、ATP合成が見えないという事のみでしょうか。酸素消費や何かの呼吸鎖酵素の活性は文献値に近いものでしょうか。作製法はどういった方法で、超遠心でSMPを沈殿させて得ているのでしょうか。タンパク量などから、得られるSMP量が妥当なのか、少なかったり、やたら多かったり。 ATP合成をどうやって測定しているかににも拠ると思います。

亜ミトコンドリア粒子 削除/引用 No.7734-1 - 2019/03/05 (火) 14:45:18 - おお ラット肝ミトコンドリア由来の亜ミトコンドリア粒子の調製を行っているのですが、上手くいかず、難航しています。 後の実験でATP合成を測定しようと思っているため、 ミトコンドリアの単離とSMPの調製を同時に行うのが難しく、 ラット肝臓ミトコンドリアは−80℃で凍結したものを使用しています。 これが原因かどうかは分からないのですが、得られた産物から、ATP合成を測定することができませんでした。 どなたか、アドバイスを頂けると幸いです。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---